Giardia duodenum-ը մակաբույծ օրգանիզմ է, որն առաջացնում է գիարդիազ՝ աղիքային վարակ, որը հատկապես տարածված է լուծի կլինիկական նշաններով փոքր երեխաների մոտ:Մենք նախկինում հայտնել ենք, որ արտաբջջային G. duodenalis-ը հրահրում է ներբջջային օլիգոմերացման նման ընկալիչ 3 (NLRP3) կապող նուկլեոտիդների ակտիվացումը և կարգավորում հյուրընկալող բորբոքային պատասխանները արտաբջջային վեզիկուլային (EV) սեկրեցիայի միջոցով:Այնուամենայնիվ, այս գործընթացում ներգրավված պաթոգեն հետ կապված տասներկումատնյա աղիքի դիոդենոկոկային EV-ի (GEV) ճշգրիտ մոլեկուլային օրինաչափությունները և NLRP3 բորբոքման դերը ջարդիոզում դեռևս պետք է պարզաբանվեն:
Ռեկոմբինանտ էուկարիոտիկ էքսպրեսիայի պլազմիդները pcDNA3.1(+)-ալֆա-2 և ալֆա-7.3 գիարդինները GEV-ում կառուցվել են, փոխակերպվել մկների առաջնային որովայնային մակրոֆագների մեջ և հայտնաբերվել բորբոքման թիրախային մոլեկուլի կասպազ-1-ի չափման միջոցով:Ցուցադրվել է p20 արտահայտության մակարդակը:.G. duodenalis ալֆա-2 և ալֆա-7.3 գիարդիններն ի սկզբանե բացահայտվել են NLRP3 բորբոքային (NLRP3, պրո-ինտերլեյկին-1 բետա [IL-1β], պրո-կասպազա-1 և կասպազա-1 p20), IL սեկրեցիայի չափման միջոցով:1β մակարդակները, ապոպտոտիկ խայտաբղետ սպիտակուցի (ASC) օլիգոմերացման մակարդակները և NLRP3-ի և ASC-ի իմունֆլյուորեսցենտային տեղայնացումը:NLRP3 բորբոքման դերը G. duodenalis-ի պաթոգենության մեջ այնուհետև գնահատվել է մկների միջոցով, որոնցում արգելափակվել է NLRP3-ի ակտիվացումը (NLRP3 արգելափակված մկներ) և վերահսկվել են մարմնի քաշի, տասներկումատնյա աղիքի մակաբուծական բեռի և տասներկումատնյա աղիքի հյուսվածքի պաթոլոգիական փոփոխությունները:Բացի այդ, մենք ուսումնասիրեցինք, թե արդյոք հիարդինները ալֆա-2-ը և ալֆա-7.3-ը հրահրում են IL-1β սեկրեցիա in vivo-ի միջոցով NLRP3 բորբոքման միջոցով և որոշեցինք այս մոլեկուլների դերը մկների մոտ G. duodenalis-ի պաթոգենության մեջ:
Ալֆա-2 և ալֆա-7.3 գիարդինները in vitro-ում հրահրում են NLRP3 բորբոքման ակտիվացումը:Սա հանգեցրեց p20 կասպազա-1-ի ակտիվացմանը, NLRP3, պրո-IL-1β և պրոկասպազա-1 սպիտակուցների արտահայտման մակարդակի բարձրացմանը, IL-1β սեկրեցիայի զգալի աճին, ASA բծերի ձևավորմանը: ցիտոպլազմա և ASA օլիգոմերացման ինդուկցիա:NLRP3 բորբոքում Առնանդամի կորուստը սրում է G. duodenalis-ի պաթոգենությունը մկների մոտ:NLRP3-արգելափակված մկների կիստաներով բուժված մկների մոտ դրսևորվել է տրոֆոզոիտների քանակի ավելացում և տասներկումատնյա աղիքների ծանր վնաս, որոնք բնութագրվում են նեկրոտիկ կրիպտներով՝ նեղացած և ճյուղավորված:In vivo փորձերը ցույց են տվել, որ giardines ալֆա-2-ը և ալֆա-7.3-ը կարող են առաջացնել IL-1β-ի սեկրեցիա NLRP3 բորբոքման միջոցով, իսկ գիարդինների ալֆա-2 և ալֆա-7.3 իմունիզացիան նվազեցրել է G. duodenalis-ի ախտածինությունը մկների մոտ:
Միասին, այս հետազոտության արդյունքները ցույց են տալիս, որ giardia alpha-2-ը և alpha-7.3-ը առաջացնում են հյուրընկալող NLRP3 բորբոքման վերակարգավորում և նվազեցնում G. duodenalis-ի վարակիչությունը մկների մոտ, որոնք խոստումնալից թիրախներ են գիարդիոզի կանխարգելման համար:
Giardia duodenum-ը արտաբջջային նախակենդանի մակաբույծ է, որն ապրում է բարակ աղիքում և տարեկան առաջացնում է 280 միլիոն լուծով ժայարդիազի դեպք, հատկապես զարգացող երկրների փոքր երեխաների մոտ [1]:Մարդիկ վարակվում են խմելու ջրով կամ M. duodenum կիստաներով աղտոտված սննդով, որոնք այնուհետև մտնում են ստամոքս և արտազատվում ստամոքսահյութերով:Giardia տասներկումատնյա աղիքի տրոֆոզոիտները կցվում են տասներկումատնյա աղիքի էպիթելիում, առաջացնելով սրտխառնոց, փսխում, փորլուծություն, որովայնի ցավ և քաշի կորուստ:Իմունային անբավարարությամբ և կիստիկական ֆիբրոզով մարդիկ ենթակա են վարակի:Վարակումը կարող է առաջանալ նաև օրալ և անալ սեքսի միջոցով [2]:Դեղամիջոցները, ինչպիսիք են մետրոնիդազոլը, տինիդազոլը և նիտազոքսանիդը, հանդիսանում են տասներկումատնյա աղիքի վարակների բուժման նախընտրելի տարբերակները [3]:Այնուամենայնիվ, քիմիաթերապիայի այս դեղամիջոցները առաջացնում են անբարենպաստ կողմնակի ազդեցություններ, ինչպիսիք են սրտխառնոցը, քաղցկեղածինությունը և գենոտոքսիկությունը [4]:Հետևաբար, անհրաժեշտ է մշակել ավելի արդյունավետ ռազմավարություններ G. duodenalis վարակի կանխարգելման համար:
Բորբոքվածները ցիտոզոլային սպիտակուցային համալիրների դաս են, որոնք բնածին իմունային պատասխանի մի մասն են կազմում, որոնք օգնում են պաշտպանվել պաթոգենների ներխուժումից և միջնորդել բորբոքային պատասխանները [5]:Այս բորբոքումների շարքում լայնորեն ուսումնասիրվել է նուկլեոտիդ կապող օլիգոմերացման (NOD) ընկալիչ 3 (NLRP3) նուկլեոտիդ կապող օլիգոմերացում (NLRP3) նուկլեոտիդ կապող նման բորբոքում, քանի որ այն կարող է հայտնաբերվել տարբեր պաթոգեն/վնասների հետ կապված մոլեկուլային օրինաչափություններով: DAMP), ճանաչում, ակտիվացնում է բնածին իմունային համակարգը:և կարգավորում է աղիքային հոմեոստազը բազմաթիվ բորբոքային հիվանդությունների դեպքում [6,7,8]:Այն բաղկացած է օրինաչափությունների ճանաչման ընկալիչից (PRR) NLRP3, ադապտերային ապոպտոտիկ բծավոր սպիտակուցից (ASC) և էֆեկտոր պրոկասպազ-1 կամ պրոկասպազա-11:NLRP3 բորբոքային համակարգը գործում է որպես հյուրընկալող պաթոգեն ներխուժման դեմ, ինչպես նկատվել է Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10] և Leishmania ուսումնասիրություններում:[11], բայց նաև հաղորդվել է, որ NLRP3 բորբոքման ակտիվացումը սահմանափակում է պաշտպանիչ իմունային պատասխանները և խորացնում հիվանդության առաջընթացը, օրինակ՝ որդերի մոտ [12]:Հիմնվելով մեր նախորդ բացահայտումների վրա՝ մենք հայտնել ենք, որ արտաբջջային G. duodenalis-ը հրահրում է NLRP3 բորբոքման ներբջջային ակտիվացումը և մոդուլավորում է հյուրընկալող բորբոքային պատասխանները՝ արտաբջջային վեզիկուլներ (EVs) արտազատելով [13]:Այնուամենայնիվ, NLRP3 ինֆլմազոմի դերը G. duodenalis վարակի մեջ in vivo-ում դեռ պետք է որոշվի:
Ջարդիններն ի սկզբանե նկարագրվել են որպես G. duodenalis ցիտոկմախքի կառուցվածքային բաղադրիչներ և կարևոր դեր են խաղում տրոֆոզոյտների շարժունակության և էպիթելային բջիջների կցման գործում բարակ աղիքներում:Շրջակա միջավայրին ավելի լավ հարմարվելու և դրանց ախտածինությունը մեծացնելու համար G. duodenalis trophozoites-ը մշակել է եզակի ցիտոկմախքի կառուցվածք, որը բաղկացած է 8 դրոշակներից, 1 միջին մարմնից և 1 փորային սկավառակից [14]:Giardia տասներկումատնյա աղիքի տրոֆոզոիտներն օգտագործում են իրենց ցիտոկմախքը՝ ներթափանցելու վերին բարակ աղիքներ, հատկապես տասներկումատնյա աղիքի մեջ և միանում են էնտերոցիտներին։Նրանք անընդհատ գաղթում են և միանում են էպիթելային բջիջներին՝ օգտագործելով բջջային նյութափոխանակությունը։Հետևաբար, սերտ կապ կա նրանց ցիտոկմախքի և վիրուլենտության միջև:Giardia duodenum-ի համար հատուկ Giardines-ը ցիտոկմախքի կառուցվածքի բաղադրիչներն են [15] և բաժանված են չորս դասերի՝ α-, β-, γ- և δ-գիարդիններ:Գոյություն ունի α-giardin ընտանիքի 21 անդամ, որոնք բոլորն ունեն կալցիումից կախված ֆոսֆոլիպիդները կապելու ունակություն [16]:Նրանք նաև կապում են ցիտոկմախքը բջջային թաղանթին։G. duodenalis-ով առաջացած փորլուծությամբ անհատների մոտ α-գիարդինները բարձր արտահայտված են և իմունռեակտիվ են վարակի ժամանակ [17]:Giardia alfa-1-ի վրա հիմնված հետերոլոգ պատվաստանյութերը պաշտպանում են մկների մոտ ջարդիազից և հանդիսանում են պատվաստանյութի մշակման պոտենցիալ թեկնածու անտիգեններ [18]:Ալֆա-8 գիարդինը, որը տեղայնացված է պլազմային թաղանթում և դրոշակում, բայց ոչ փորային սկավառակում, ուժեղացնում է տրոֆոզոիտների շարժունակությունը և աճի արագությունը G. duodenalis-ում [19]:Ալֆա-14 գիարդինը կպչում է դրոշակի վրա գտնվող միկրոխողովակային կառուցվածքներին և ազդում G. duodenalis-ի կենսունակության վրա [20]:Ալֆա-11 գիարդինը առատորեն առկա է ողջ կյանքի ցիկլի ընթացքում, և ալֆա-11 գիարդինի գերարտահայտումը վնասում է հենց G. duodenalis-ին [21]:Այնուամենայնիվ, պարզ չէ, թե արդյոք ալֆա-2 գիարդինը և ալֆա-7.3 գիարդինը պաշտպանում են G. duodenalis վարակի և դրանց հիմքում ընկած մեխանիզմների դեմ:
Այս հետազոտության մեջ, ռեկոմբինանտ էուկարիոտիկ էքսպրեսիայի պլազմիդները pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine և pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine փոխարկվել են մկների առաջնային peritoneal մակրոֆագների մեջ՝ ակտիվացնելու հյուրընկալող NLRP3-ը:Այնուհետև ստուգվել են բորբոքային թիրախները:Մենք նաև գնահատեցինք NLRP3 բորբոքման դերը G. duodenalis-ի պաթոգենության մեջ, ուսումնասիրեցինք, թե արդյոք ալֆա-2 և ալֆա-7,3 գիարդինները հրահրում են NLRP3 բորբոքման ակտիվացումը in vivo, և որոշեցինք, որ գիարդինների այս երկու դերերը պաթոգենության մեջ: G. duodenalis.Մեր ընդհանուր նպատակն էր մշակել խոստումնալից թիրախներ G. duodenalis վարակի կանխարգելման համար:
Վայրի տեսակի (WT) C57BL/6 5-8 շաբաթական էգ մկներ գնվել են Լիաոնինգ Չանգշենգի փորձարարական կենդանիների կենտրոնից (Լիաոնինգ, Չինաստան):Մկներն ազատ մուտք են ունեցել ջուր, ստացել են ստերիլիզացված սնունդ և պահվել 12/12 ժամ լույս/մութ ցիկլի մեջ:Մինչ վարակը, մկները ստացել են հակաբիոտիկներ ad libitum խմելու ջրի մեջ՝ լրացված ամպիցիլինի (1 մգ/մլ), վանկոմիցինով (1 մգ/մլ) և նեոմիցինով (1,4 մգ/մլ) (բոլորը գնված են Շանհայից, Չինաստանից, արհեստական ​​օրգանիզմներից) [22: ]։]։Մկները, որոնք կորցրել են ուտելու և խմելու ունակությունը ավելի քան 24 ժամ և կորցրել են ≥ 20% մարմնի քաշը, ենթարկվել են մարդկայնորեն էվթանազիայի՝ արգանդի վզիկի տեղաշարժով:
WB G. duodenalis trophozoites (American Type Culture Collection, Manassas, ԱՄՆ) համալրվել է 12,5% պտղի խոշոր եղջերավոր անասունի շիճուկով (FBS; Every Green, Zhejiang, Չինաստան) և 0,1% խոշոր եղջերավոր անասունի մաղձով (Sigma-Aldrich, St. Missouri, ԱՄՆ): ).ԱՄՆ) միկրոաէրոբ պայմաններում:Միաձուլվող տրոֆոզոիտները հավաքվել են սառույցի վրա և 1:4 հարաբերակցությամբ անցնել հետագա վերարտադրության համար:
Giardia տասներկումատնյա աղիքի կիստաներն առաջացել են, ինչպես նկարագրված է նախկինում [23], տրոֆոզոիտները հավաքվել են լոգարիթմական փուլում, այնուհետև նոսրացվել են պարկուճ առաջացնող միջավայրով, pH 7.1 (փոփոխված TYI-S-33) մինչև 1 × 106 տրոֆոզոիտներ/մլ վերջնական կոնցենտրացիան:լեղու կոնցենտրացիան 0.05% միջին):Տրոֆոզոիտները մշակվել են անաէրոբ պայմաններում 37°C ջերմաստիճանում մինչև լոգարիթմական աճի փուլը:Փոխեք միջավայրը կիստա հրահրող միջավայրի (pH 7,8, փոփոխված TYI-S-33 միջավայր՝ 1% լեղու կոնցենտրացիայով) և G. duodenalis մշակեք 37°C ջերմաստիճանում 48–96 ժամվա ընթացքում, որի ընթացքում կիստաների առաջացումը դիտարկվել է մանրադիտակի տակ:Այն բանից հետո, երբ տրոֆոզոիտների մեծ մասը առաջացել էր կիստաներ, կուլտուրայի խառնուրդը հավաքվեց և նորից կասեցվեց ստերիլ դեիոնացված ջրի մեջ՝ մնացած տրոֆոզոիտները լիզելու համար:Կիստերը հաշվվել և պահվել են 4°C ջերմաստիճանում մկների ստամոքսային խողովակի միջոցով հետագա անալիզների համար:
Giardia արտաբջջային vesicles (GEVs) հարստացվել են, ինչպես նկարագրված է նախկինում [13]:Տրոֆոզոիտները լոգարիթմական աճի փուլում կրկին կասեցվել են մոդիֆիկացված TYI-S-33 միջավայրում, որը պատրաստված է էկզոսոմից սպառված FBS-ով (Biological Industries, Beit-Haemek, Իսրայել) մինչև 1 × 106 մակաբույծ/մլ վերջնական կոնցենտրացիան և ինկուբացվել է 12 ժամ:մեկուսացվել են կուլտուրայի վերին հեղուկից ցենտրիֆուգմամբ 2000 գ 10 րոպեի ընթացքում, 10000 գ 45 րոպեի ընթացքում և 100000 գ 60 րոպեի ընթացքում:Նստվածքները լուծվել են ֆոսֆատով բուֆերացված ֆիզիոլոգիական լուծույթում (PBS), քանակականացվել են BCA սպիտակուցի փորձարկման հավաքածուի միջոցով (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ԱՄՆ) և պահվել -80°C-ում կամ ուղղակիորեն օգտագործվել հետագա անալիզների համար:
Մկների առաջնային որովայնային մակրոֆագները պատրաստվել են ինչպես նախկինում [24]:Համառոտ, մկներին (6-8 շաբաթական տարիքի) ներարկեցին (intraperitoneally [ip]) 2,5 մլ 2,98% Difco հեղուկ թիոգլիկոլ միջավայր (BD, Franklin Lakes, NJ, ԱՄՆ) և կերակրեցին 3-4 քիմք:Էվթանազիայից հետո մկների որովայնի խոռոչից հավաքվել է մակրոֆագների կասեցում և ցենտրիֆուգվել 3 անգամ 1000 գ 10 րոպեի ընթացքում:Հավաքած բջիջները հայտնաբերվել են հոսքի ցիտոմետրիայի միջոցով՝ օգտագործելով CD11b մարկեր, մինչև բջիջների մաքրությունը 98%-ից բարձր լինի, այնուհետև ավելացվել է 6-հորատանցքի բջիջների կուլտուրայի թիթեղներին (4,5 x 106 բջիջ/հոր) և ինկուբացվել 10% FBS (Կենսարդյունաբերություն) 37°C-ում:և 5% CO2:
ՌՆԹ-ն արդյունահանվել է 1 × 107 տրոֆոզոիտից 1 մլ ՏՐԻզոլ ռեագենտում (Vazyme, Նանջինգ, Չինաստան), գենոմային ԴՆԹ-ն արդյունահանվել է ընդհանուր G. duodenalis ՌՆԹ-ից MonScript dsDNase-ի միջոցով (Monad, Wuhan, Չինաստան) և սինթեզվել է կոմպլեմենտար ԴՆԹ (cDNA): օգտագործելով MonScript RTIIII Super Mix (Monad)՝ ըստ արտադրողի ցուցումների:
CDS-ի հաջորդականության մասին տեղեկատվությունը թիրախ G. duodenalis գենի համար ստացվել է NCBI GenBank-ից:Օգտագործեք Primer 5.0՝ յուրաքանչյուր թիրախային գենի համար հատուկ անխափան կլոնավորման պրայմերներ մշակելու համար:Առաջատար այբբենարանը (5'-3') բաղկացած է երեք մասից՝ համընկնող հաջորդականություն գծային վեկտոր pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) և մեկնարկային ATG և GNN կոդոններ (եթե առաջին հիմքը G չէ):Սա արվում է արտահայտման արդյունավետությունը բարելավելու համար:Բացի այդ, առնվազն 16 bp համակցված հիմքեր (GC պարունակությունը 40–60%/Tm մոտ 55 °C):Հակադարձ այբբենարանը (5'-3') բաղկացած է երկու մասից՝ համընկնող հաջորդականություն EcoRV-գծայինացված pcDNA3.1(+) վեկտորով (GCCGCCACTGTGCTGGAT) և առնվազն 16 bp համակցված հիմքով:(բացառությամբ վերջին երկու կանգառների):հիմքեր) կոդոն, ինչպիսին է AA կամ GA, որը թույլ կտա ռեկոմբինանտ պլազմիդներին արտահայտել իրենց պիտակավորված սպիտակուցները):Պրայմերների հաջորդականությունները թվարկված են Աղյուսակ 1-ում և սինթեզվել են Kangmet Biotechnology Co., Ltd.-ի կողմից (Չանչուն, Չինաստան):
Թիրախներն ուժեղացվել են Pfu ԴՆԹ պոլիմերազի միջոցով (Tiangen, Պեկին, Չինաստան) կամ Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Պեկին, Չինաստան) օգտագործելով պատրաստված G. duodenalis cDNA որպես ձևանմուշ:Էուկարիոտիկ էքսպրեսիայի վեկտորի պլազմիդ pcDNA3.1(+) գծայինացվել է սահմանափակող ֆերմենտի EcoRV-ով և դեֆոսֆորիլացվել է Fast AP-ի (Thermo Fisher Scientific) միջոցով:Գծայինացված pcDNA3.1 (+) բեկորները և ուժեղացված թիրախային գենի բեկորները մաքրվել են ԴՆԹ գելի մաքրման հավաքածուի միջոցով (Tiangen) և քանակականացվել՝ օգտագործելով Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific):pcDNA3.1(+) հատվածը և յուրաքանչյուր թիրախ գենի հատվածը վերամիավորվել են MonClone մեկ հավաքման կլոնավորման խառնուրդի միջոցով (Monad Biotech Co., Ltd., Սուչժոու, Չինաստան) և հաստատվել ԴՆԹ-ի հաջորդականությամբ՝ օգտագործելով Comate Bioscience Company Limited (Չանչուն, Չինաստան):.
Էնդոտոքսինից զերծ պլազմիդները pcDNA3.1(+)-ալֆա-2 և pcDNA3.1(+)-ալֆա-7.3 ստեղծվել են SanPrep Endotoxin-ից զերծ Plasmid Mini Kit-ի միջոցով (Sangon Biotech):Կոնցենտրացիան պահպանվել է 500 նգ/մլ-ից բարձր՝ ապահովելու համար, որ EDTA-ն էլուցիոն բուֆերի մեջ չի խանգարում տրանսֆեկցիոն փորձարկմանը:Առաջնային մկների որովայնային մակրոֆագները 12 ժամ աճեցվեցին 6 հորատանցքի ափսեներում ամբողջական RPMI 1640 միջավայրով (Biological Industries), այնուհետև բջիջները լվացվեցին 3 անգամ տաք PBS-ով, որպեսզի հեռացնեն պենիցիլինի և streptomycin-ը, այնուհետև այն միջավայրում, որը լրացվեց ամբողջական միջավայրով:Էնդոտոքսին չպարունակող պլազմիդները pcDNA3.1(+)-alpha-2 և pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (2.5 μg) նոսրացվել են 125 մկլ Opti-MEM կրճատված շիճուկ միջավայրում (Gibco, Thermo Fisher Scientific):.Այնուհետև 5 մկլ Lipofectamine 2000 տրանսֆեկցիոն ռեագենտ (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) նոսրացվել է 125 մկլ ցածր շիճուկ Opti-MEM միջավայրում:Պատրաստեք լիպոսոմ-ԴՆԹ կոմպլեքսները՝ խառնելով նոսրացված էնդոտոքսինից զերծ պլազմիդը Lipofectamine 2000-ի հետ և թույլ տալով, որ խառնուրդը մնա սենյակային ջերմաստիճանում 5 րոպե:Կոմպլեքսները առանձին տեղափոխեք յուրաքանչյուր ջրհորի բջիջներ և դանդաղ խառնեք։4 ժամ հետո բջիջների կուլտուրայի միջավայրը փոխարինվեց 2 մլ ամբողջական RPMI 1640 միջավայրով և մշակումը շարունակվեց 24 ժամ:Բջջային կուլտուրայի թարմ միջավայրը ավելացվել է բջիջներին և ինկուբացվել տարբեր ժամանակային կետերում՝ կախված վերլուծության ձևից:
Սպիտակուցի նմուշները վերևից և բջիջների լիզատներից պատրաստվել են ինչպես նախկինում [25]:Մեմբրանի փոխանցման պարամետրերը pro-IL-1β, pro-caspase-1, caspase-1 p20, NLRP3, β-ակտինի և His-tag-ի համար եղել են 200 մԱ/90 րոպե:ինտերլեյկին 1β (IL-1β; R&D Systems, Մինեապոլիս, Մինեսոտա, ԱՄՆ), կասպազա-1 (p20) (Adipogen, Շվեյցարիա) և NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Շվեյցարիա) և 1:5000՝ ուղղված Նրա պիտակին ( Amylet Scientific, Ուհան, Չինաստան) և β-ակտին (Proteintech, Ուհան, Չինաստան):
Դիսուկցինիմիդային սուբերատի (DSS) հետ խաչաձև կապն իրականացվել է ինչպես նախկինում [26]:Բջիջները լվացվել են 3 անգամ սառը PBS-ով և ամբողջությամբ լուծվել 27 չափիչ ասեղով 50 մկլ ASC ռեակցիայի բուֆերի մեջ (pH 8,0), որը պարունակում է 25 մՄ Na2PO4, 187,5 մՄ NaCl, 25 մՄ HEPES և 125 մՄ NaHCO3:Խառնուրդը ցենտրիֆուգվել է 5000 գ-ում 3 րոպե, և գնդիկը կարվել է 10 մկլ DSS (25 մՄ DMSO-ում) և 40 մկլ ASC ռեակցիայի բուֆերով 30 րոպե 37°C-ում:10 րոպե 5000 գ-ում ցենտրիֆուգումից հետո գնդիկը լուծարվեց 40 մկլ ASC ռեակցիայի բուֆերի և 10 մկլ 6x սպիտակուցը բեռնող բուֆերի լուծույթում (TransGen, Պեկին, Չինաստան), այնուհետև լուծույթը հանգցրեց սենյակային ջերմաստիճանում 15 ժամ: ր., Ապա եռացրեք 10 րոպե։Այնուհետև սպիտակուցի նմուշները ենթարկվել են Western blotting-ի՝ օգտագործելով առաջնային հակա-ASC հակամարմիններ (Wanleibio, Shenyang, Չինաստան) նոսրացման հարաբերակցությամբ 1:500:
Հետևելով նախկինում նկարագրված ընթացակարգին [13], բջիջների կուլտուրայի վերին նյութերը հավաքվեցին և որոշվեց IL-1β պրոբորբոքային ցիտոկինի սեկրեցումը մկնիկի IL-1 Beta ELISA հավաքածուի միջոցով (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific):Փոխակերպեք OD450nm արժեքները սպիտակուցի կոնցենտրացիաների՝ օգտագործելով IL-1β ստանդարտ կորը:
Ծածկույթների վրա պատված բջիջները նրբորեն լվացվեցին 3 անգամ տաք PBS-ով, ամրացվեցին հյուսվածքային բջիջների ֆիքսատորում (Biosharp, Պեկին, Չինաստան) 10 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում (RT), 0,1% Triton X-Permeabilize-ում 100 (նոսրացված PBS-ում, Biosharp): 20 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում և արգելափակել 5% տավարի շիճուկի ալբումինում (PBS-ով) 2 ժամով սենյակային ջերմաստիճանում:Բջիջներն այնուհետև ինկուբացվել են գիշերը 4°C ջերմաստիճանում ASC-ի (1:100 նոսրացում) կամ NLRP3-ի (1:100 նոսրացում) դեմ առաջնային հակամարմիններով և Cy3 պիտակավորված այծի հակաճագարային IgG(H+L) (1:400; EarthOx): , Սան Ֆրանցիսկո, Կալիֆորնիա, ԱՄՆ) կամ FITC-ի կոնյուգացված այծի հակամկնիկի IgG (1:400; Earthox) գիշերը 37°C մթության մեջ 1 ժամ:Միջուկները ներկվել են Hoechst 33258-ով (10 մկգ/մլ; UE, Սուչժոու, Չինաստան) 5 րոպե և դիտարկվել են ֆլյուորեսցենտային մանրադիտակի տակ (Olympus Corporation, Տոկիո, Ճապոնիա):
Մկները բաժանվել են չորս խմբի (n = 7 յուրաքանչյուր խմբում). (i) PBS-ով բուժված բացասական հսկողության խումբ (միայն PBS; 100 մկլ/մկնիկի PBS ներարկում, որին հաջորդում է օրական 100 մկլ/մկնիկի PBS ներարկում 3 ժամ անց):, անընդհատ 7 օր);(ii) բացասական հսկողության խումբ, որը բուժվել է MCC950 ինհիբիտորով [27] (100 մկլ/մուկ PBS գավաթի միջոցով, 3 ժամ անց, 10 մգ/կգ մարմնի քաշի [BW] MCC950 [PBS-ում] ներարկվել է օրական ներպերիտոնային, 7 օր տևողությամբ);(iii) G. duodenalis ցիստի վարակի խումբ (1,5 x 106 կիստա/մկնիկ՝ գավաթով, 3 ժամ անց, 100 մկլ/մկնիկի PBS ներերակային օրական 7 օրվա ընթացքում);(iv) G. duodenalis կիստաների համակցված վարակի խմբի MCC950 ինհիբիտորների բուժման խումբ (1,5×106 կիստա/մուկ՝ գավաթի միջոցով, 10 մգ/կգ մարմնի քաշի MCC950 օրական 7 օրվա ընթացքում 3 ժամվա ընթացքում):Յուրաքանչյուր մկան մարմնի քաշը վերահսկվում էր ամեն օր, և բոլոր մկները 7-րդ օրը ենթարկվեցին էվթանազիայի:Հավաքած տասներկումատնյա աղիքը (3 սմ երկարություն) կտրվել է փոքր կտորների 1 մլ PBS-ում, կիստաները ոչնչացվել են գիշերվա ընթացքում PBS-ում 4°C-ում և G. duodenalis տրոֆոզոիտները:Թարմ տասներկումատնյա աղիքը (1 սմ երկարություն) մեկուսացվել է հեմատոքսիլինով և էոզինով (H&E) ներկելու համար:
Մկները բաժանվել են երկու խմբի՝ (i) MOCK վերահսկիչ խումբ և (ii) MCC950 արգելակող խումբ:Յուրաքանչյուր խմբում եղել է հինգ բուժում (n = 7/բուժման խումբ). (i) PBS բուժման բացասական հսկողության խումբ (միայն PBS; 100 μl/մկնիկի PBS, ներմկանային (IM) ներարկում (tibialis anterior) [28, 29] ;( ii) pcDNA3.1(+) պլազմիդային բացասական հսկողության խումբ (100 μg/մկնիկի ԴՆԹ, ներմկանային ներարկման միջոցով) խումբ, որը բուժվել է պլազմիդ pcDNA3.1(+)-ալֆա-2 (100 մկգ/մկնիկի ԴՆԹ, միջմկանային ներարկումով) և (v) խումբ, որը բուժվել է պլազմիդ pcDNA3.1(+)-ալֆա-7.3 (100 մկգ/մուկ. ԴՆԹ-ն, 12 ժամ անցումից հետո, MCC950 արգելակող խմբի մկները ստացել են MCC950 (10 մգ/կգ մարմնի քաշ) օրական ներերակային ներարկում 7 օրվա ընթացքում, մինչդեռ MOCK խմբի մկները ստացել են PBS բուժման հավասար ծավալ: Արյան նմուշները ստացվել են: հավաքվել են ակնագնդերի մկներից և թողնվել գիշերը 4 °C ջերմաստիճանում:
Երեսունհինգ մկները բաժանվել են հինգ խմբի (n=7/խումբ):1-ին խումբը բացասական հսկողության խումբ էր, որը բուժվել էր PBS-ով. մկները ստացել էին 100 մկլ PBS ներմկանային և 3 օր անց գավաթով:2-րդ խումբը դրական հսկողության խումբ է, որը վարակված է G. duodenalis կիստաներով. մկներին ներարկվել է 100 մկլ PBS, իսկ 3 օր անց 1,5 x 106 կիստա/մուկ ներարկվել է ներգաստրային ճանապարհով:Երրորդ խումբ – պլազմիդային իմունիզացիա pcDNA3.1(+)-ով տասներկումատնյա աղիքի կիստա վարակի վերահսկիչ խմբի հետ համատեղ. մկները ստացել են 100 մկգ պլազմիդային ԴՆԹ pcDNA3.1(+)(im) բանավոր, 1.5×106 կիստա/մուկ 3 մի քանիսի համար։ օրեր.4-րդ և 5-րդ խմբերը եղել են ռեկոմբինանտ pcDNA3.1(+)-ալֆա-2 giardine պլազմիդ կամ pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine պլազմիդ G. duodenalis ցիստի վարակի հետ համատեղ:Փորձարարական խումբ. մկները ստացել են 100 մկգ pcDNA3:1(+)-giardine պլազմիդային ԴՆԹ (im), ապա 3 օր անց 1,5 × 106 կիստա/մուկ ներարկվել է գավաթի միջոցով:Յուրաքանչյուր մկնիկի մարմնի քաշը վերահսկվել է խողովակի միջով G. duodenalis կիստի ներմուծումից հետո:Թարմ տասներկումատնյա աղիքը հավաքվել է մակաբուծական բեռի չափման և HE ներկման վերլուծության համար:
Հիստոպաթոլոգիական փոփոխությունները վերլուծվել են նախկինում հրապարակված ընթացակարգի համաձայն [30]:Թարմ տասներկումատնյա աղիքը ֆիքսվել է հյուսվածքային բջիջների ֆիքսատորով, ներկառուցվել պարաֆինի մեջ, կտրվել 4 մկմ հատվածների, ներկվել է H&E-ով և վերլուծվել լուսային մանրադիտակի տակ:Յոթ անկախ մկների յոթ հյուսվածքային հատվածների ներկայացուցչական պաթոլոգիական փոփոխությունները գնահատվել են բուժման մասին անտեղյակ պաթոլոգի կողմից և ֆիքսվել են 200x մեծացմամբ:Վիլլիների երկարությունը և կրիպտների խորությունը չափվել են նախկինում նկարագրված մեթոդների համաձայն:
Արդյունքները in vitro և in vivo ստացվել են եռակի:Գրաֆիկները ստեղծվել են GraphPad Prism 7.00-ի միջոցով (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, ԱՄՆ):Երկու խմբերի միջև եղած տարբերությունները վերլուծվել են t-test-ով, մինչդեռ ≥3 խմբերի միջև եղած տարբերությունները վերլուծվել են միակողմանի շեղումների վերլուծությամբ (ANOVA)՝ օգտագործելով SPSS ծրագրաշարը (տարբերակ 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, ԱՄՆ):Տվյալները վերլուծվել են շեղումների միատարրության համար՝ օգտագործելով Լևենի թեստը, որին հաջորդում է Բոնֆերոնիի հետհոկ թեստը (B):Նշանակությունը արտահայտվում է որպես P<0.05, P<0.01 և P<0.001 (ոչ էական [ns]) (P>0.05):
GEV proteomics-ի մեր նախորդ վերլուծությունը Կիոտոյի գեների և գենոմների հանրագիտարանում (KEGG) ցույց տվեց, որ շատ թիրախներ կարող են ներգրավված լինել բորբոքային ազդանշանային ուղիների ակտիվացման մեջ [13]:Մենք ընտրեցինք երկու խոստումնալից թիրախներ՝ ալֆա-2 և ալֆա-7.3 գիարդիններ, ուժեղացրեցինք այս մոլեկուլները և օգտագործեցինք դրանք pcDNA3.1(+) էուկարիոտիկ արտահայտման վեկտորը կառուցելու համար:Հերթականացումից հետո, ռեկոմբինանտ pcDNA3.1(+)-ալֆա-2 և ալֆա-7.3 գիարդինային էքսպրեսիայի պլազմիդները տրանսֆեկցվել են մկների առաջնային որովայնային մակրոֆագների մեջ, և հայտնաբերվել է բորբոքման կասպազ-1 p20 սպիտակուցը (ակտիվացված կասպազ-1-ի մի հատված): որպես պարզաբանող առանցքային մոլեկուլներ, որոնք կարող են առաջացնել բորբոքում:Արդյունքները ցույց են տվել, որ ալֆա-2 և ալֆա-7.3 գիարդինները կարող են առաջացնել p20 կասպազա-1 արտահայտում, որը նման է GEV-ին:Կասպազ-1-ի ակտիվացման վրա ազդեցություն չի հայտնաբերվել չմշակված բացասական հսկողության (միայն PBS) և պլազմիդային հսկողության pcDNA3.1(+) (Նկար 1):
p20 caspase-1-ի ակտիվացման չափում pcDNA3.1(+)-ալֆա-2 և ալֆա-7.3 գիարդիններով:Էուկարիոտիկ էքսպրեսիայի ռեկոմբինանտ պլազմիդները pcDNA3.1(+)-ալֆա-2 և ալֆա-7.3 գիարդինները (յուրաքանչյուր գծի վերևում) տրանսֆեկցվել են մկների առաջնային որովայնային մակրոֆագների մեջ և 24 ժամ անց հավաքվել են կուլտուրայի սուպերնատանտները:Western blotting-ը օգտագործվել է բորբոքային կասպազա-1 p20 բորբոքային սպիտակուցի արտահայտման մակարդակը չափելու համար:Միայն PBS-ով բուժման խումբը (ուղի C) և pcDNA3.1 (+) մոնոթերապիայի խումբը (pcDNA3.1 գիծ) օգտագործվել են որպես բացասական հսկողություն, իսկ GEV բուժման խումբը՝ որպես դրական հսկողություն:Ռեկոմբինանտ սպիտակուցի արտահայտությունը հաստատվել է յուրաքանչյուր սպիտակուցի մեջ հիստիդինային պիտակի հայտնաբերմամբ, և ակնկալվող սպիտակուցային շերտերն էին ալֆա-2 գիարդինը (38,2 կԴա) և ալֆա-7,3 գիարդինը (37,2 կԴա):GEV, Giardia duodenum extracellular vesicles, pcDNA3.1(+), EcoRV-linearized vector, SUP, supernatant
Որոշելու համար, թե արդյոք ալֆա-2 գիարդինը և ալֆա-7.3 գիարդինը հրահրում են p20 կասպազա-1-ի էքսպրեսիան և դեր խաղում հյուրընկալող NLRP3 բորբոքային պատասխանի ակտիվացման գործում՝ pcDNA3.1(+)-ալֆա-2 գիարդին և pcDNA3.1(+)-ալֆա: -7.3 գիարդինը տրանսֆեկցվել է մկանների առաջնային որովայնային մակրոֆագների մեջ՝ ռեկոմբինանտ պլազմիդ ԴՆԹ-ով, և որոշվել են NLRP3 հիմնական բորբոքային սպիտակուցների արտահայտման, տեղայնացման և օլիգոմերացման մակարդակները:Այս փորձի ժամանակ GEV-ն օգտագործվել է որպես դրական հսկողության խումբ, իսկ առանց բուժման խումբը (միայն PBS) կամ pcDNA3.1 (+) տրանսֆեկցիոն բուժման խումբը եղել է բացասական խումբ:Արդյունքները ցույց են տվել, որ, ինչպես GEV խմբում, Giardin pcDNA3.1(+)-alpha-2-ի և giardin pcDNA3.1(+)-alpha-7.3-ի ռեկոմբինանտ պլազմիդային ԴՆԹ-ն հանգեցրել է NLRP3-ի, պրո-IL-1β-ի և պրո-IL-1b-ի վերակարգավորման: procaspase-1-ի և caspase-1-ի ակտիվացում (նկ. 2ա):Բացի այդ, երկու գիարդիններն էլ առաջացրել են զգալի IL-1β սեկրեցիա (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.1000; ալֆա-2 giardine. ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.0007: ).;ալֆա-7,3 գիարդին` ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P<0,0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.0047) (Նկար 2b):ASC սպիտակուցների մեծ մասը մոնոմերային է եղել առանց բուժման խմբում կամ բուժման խմբում, որը փոխակերպվել է pcDNA3.1(+) պլազմիդով, ի տարբերություն pcDNA3.1(+)-ալֆա-2-ի կամ pcDNA3.1(+)-ալֆա-ի: 7.3 գարդին.ASC-ի օլիգոմերացումը տեղի է ունեցել GEV դրական հսկողության խմբի կամ խմբի ռեկոմբինանտ պլազմիդային ԴՆԹ-ում՝ ցույց տալով օլիգոմերային ձև (Նկար 2գ):Այս նախնական տվյալները ցույց են տալիս, որ ալֆա-2 գիարդինը և ալֆա-7,3 գիարդինը կարող են առաջացնել NLRP3 բորբոքման ակտիվացում:ASC-ի և NLRP3-ի տեղայնացման հետագա իմունոֆլյուորեսցենտային ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ բացասական հսկողության խմբում ASC սպիտակուցը ցրված է ամբողջ ցիտոպլազմով և հայտնվել որպես կետային ազդանշան pcDNA3.1(+)-ալֆա-2-ի գիարդինով կամ pcDNA3-ով խթանելիս:1(+)-ալֆա-7,3 գիարդին խումբ կամ GEV դրական հսկողության խումբ (Նկար 2դ):Բացասական վերահսկողության և պլազմիդով մշակված pcDNA 3.1 խմբերում NLRP3 սպիտակուցի ազդանշանը չի հայտնաբերվել, մինչդեռ լյումինեսցենտային ազդանշանային կետ՝ ի պատասխան pcDNA3.1(+)-ալֆա-2 giardine կամ pcDNA3.1(+)-alpha-7.3: հայտնաբերվել է..Giardine-ը հայտնաբերվում է ցիտոպլազմայում կամ HEV-ի խթանման ժամանակ (նկ. 2e):Այս տվյալները հետագայում ցույց են տալիս, որ G. duodenalis giardin alpha-2 և giardin alpha-7.3 ակտիվացնում են NLRP3 բորբոքումը մկների առաջնային որովայնային մակրոֆագներում:
pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin-ը և pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin-ը ակտիվացնում են NLRP3 բորբոքվածությունը մկների որովայնային մակրոֆագներում:Փոխակերպեք էուկարիոտիկ էքսպրեսիայի ռեկոմբինանտ պլազմիդները pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin և pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin առաջնային մկների որովայնային մակրոֆագների և բջիջների մեջ, կամ հավաքեք սուպերնատանտը 24 ժամվա ընթացքում արտահայտման վերլուծության, օլիգոմերացման համար: , սեկրեցիա.և հիմնական բորբոքային սպիտակուցների տեղայնացումը:Միայն PBS-ով (C) խումբը և pcDNA3.1 (+) մեկ բուժման խումբը օգտագործվել է որպես բացասական հսկողություն, իսկ GEV բուժման խումբը՝ որպես դրական խումբ:a Հիմնական բորբոքային NLRP3 սպիտակուցները, ներառյալ NLRP3, pro-IL-1β, pro-caspase-1 և p20 caspase-1, հայտնաբերվել են Western blotting-ով:բ IL-1β-ի սեկրեցիայի մակարդակները վերին նյութերում որոշվել են ֆերմենտային կապակցված իմունոսորբենտային հետազոտության (ELISA) միջոցով:Վերահսկիչ և փորձարարական խմբերի միջև եղած տարբերությունները վերլուծվել են միակողմանի շեղումների վերլուծությամբ (ANOVA)՝ օգտագործելով SPSS ծրագրաշարի 22.0 տարբերակը:Աստղանիշները ցույց են տալիս զգալի տարբերություններ խմբերի միջև **P<0.01 և ***P<0.001:գ Պլետներում ASC օլիգոմերացման մակարդակները որոշվել են DSS խաչաձև կապող վերլուծությամբ, մինչդեռ բջջային լիզատներում ASC մակարդակները օգտագործվել են որպես բեռնման հսկողություն:դ ISC-ի տեղայնացման վիզուալիզացիա՝ իմունոֆլյորեսցենցիայի միջոցով:e Immunofluorescence օգտագործվել է NLRP3-ի տեղայնացումը պատկերացնելու համար:ASC, ապոպտոտիկ բծի նման սպիտակուց;IL, ինտերլեյկին;NLRP3, նուկլեոտիդ կապող օլիգոմերացման նման ընկալիչ 3;ns, ոչ էական (P > 0.05)
Ե՛վ G. duodenalis, և՛ GEV-ները, որոնք նա արտազատում է, ակտիվացնում են NLRP3 բորբոքվածությունը և կարգավորում հյուրընկալողի բորբոքային պատասխանները in vitro:Այսպիսով, NLRP3 ինֆլմազոմի դերը G. duodenalis-ի պաթոգենության մեջ մնում է անհասկանալի:Այս խնդիրը ուսումնասիրելու համար մենք նախագծեցինք փորձ G. duodenalis կիստայով վարակված մկների և G. duodenalis կիստա + MCC950 ինհիբիտորով վարակված մկների միջև և համեմատեցինք NLRP3 բորբոքային արտահայտությունը, երբ վարակված էին G. duodenalis կիստայով:Փորձի մանրամասն սխեման ներկայացված է Նկար 3ա-ում:Բուժման տարբեր խմբերում մկների մարմնի քաշի փոփոխությունները մշտադիտարկվել են կիստաներով վարակվելուց հետո 7 օր, և արդյունքները ցույց են տրված նկ. 3b-ում:Մաքուր PBS-ով բուժված խմբի համեմատ, արդյունքները ցույց են տվել, որ (i) G. duodenalis կիստայով վարակված մկների մարմնի քաշը նվազել է վարակվելուց հետո 3-րդ օրից մինչև 7-րդ օրը.(ii) MCC950 ինհիբիտորով բուժումը էական ազդեցություն չի ունեցել մկների մարմնի քաշի վրա:.Մեկ վարակի խմբի համեմատ, MCC950-ով բուժվող տասներկումատնյա աղիքի վարակի խմբի BW-ն նվազել է տարբեր աստիճաններով (Օր 1. ANOVA, F(3, 24) = 1.885, P = 0.0148; Օր 2. ANOVA, F(3, 24): ) = 0.4602, P<0.0001; Օր 3. ANOVA, F(3, 24) = 0.8360, P = 0.0010 (3, 24)=0.6497, P=0.0645; Օր 6. ANOVA, F(3, 24)=5.457, P=0.0175 Օր 7. ԱՆՈՎԱ, F(3, 24) = 2.893, P = 0.0202):Այս տվյալները ցույց են տալիս, որ NLRP3 inflammasome-ը պաշտպանում է մկներին զգալի քաշի կորուստից տասներկումատնյա աղիքի վարակի վաղ փուլերում (2-4 օր):Այնուհետև մենք նպատակ դրեցինք հայտնաբերել G. duodenalis տրոֆոզոիտները տասներկումատնյա աղիքի լվացման հեղուկում, և արդյունքները ներկայացված են Նկար 3c-ում:Համեմատած G. duodenalis կիստա վարակի խմբի հետ, Տրոֆոզոիտների թիվը տասներկումատնյա աղիքում զգալիորեն ավելացել է NLRP3 բորբոքման արգելափակումից հետո (t(12) = 2.902, P = 0.0133):HE-ով ներկված տասներկումատնյա աղիքի հյուսվածքները, համեմատած միայն PBS-ով և MCC950-ով բուժվող բացասական հսկողության հետ, ցույց տվեցին. ) և կրիպտային ատրոֆիա (ANOVA, F(3, 24) = 0.4716, P = 0.0089);(ii) տասներկումատնյա աղիքի մկների՝ վարակված G. duodenalis կիստաներով և բուժված MCC950 ինհիբիտորներով:տասներկումատնյա աղիքները վնասվել և մահացել են (ANOVA, F(3, 24) = 0,4903, P = 0,0144) ատրոֆիայով և կրիպտային ճյուղավորմամբ (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0, 0481) (նկ. 3d- զ) .Այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ NLRP3 ինֆլմազոմը դեր է խաղում G. duodenalis-ի պաթոգենության նվազեցման գործում:
NLRP3 բորբոքման դերը Giardia տասներկումատնյա աղիքի վարակի մեջ:Մկներին գավաժ են արել (iv) տասներկումատնյա աղիքի կիստաներով և այնուհետև բուժվել MCC950-ով կամ առանց դրա (ip):Որպես հսկիչներ օգտագործվել են մեկ բուժման խմբեր PBS կամ MCC950-ով:Փորձարարական խումբ և բուժման ռեժիմ.b Բուժման տարբեր խմբերից յուրաքանչյուրում մկների մարմնի քաշը մշտադիտարկվել է 7 օր:G. duodenalis վարակի խմբի և G. duodenalis + MCC950 վարակի բուժման խմբի միջև եղած տարբերությունը վերլուծվել է t-թեստի միջոցով՝ օգտագործելով SPSS ծրագրային տարբերակը 22.0:Աստղանիշները ցույց են տալիս էական տարբերություններ *P<0.05, **P<0.01 կամ ***P<0.001:գ Մակաբուծական բեռը որոշվել է տասներկումատնյա աղիքի լվացման հեղուկում տրոֆոզոիտների քանակի հաշվմամբ:G. duodenalis վարակի խմբի և G. duodenalis + MCC950 վարակի բուժման խմբի միջև եղած տարբերությունը վերլուծվել է t-թեստի միջոցով՝ օգտագործելով SPSS ծրագրային տարբերակը 22.0:Աստղանիշները ցույց են տալիս էական տարբերություններ *P <0.05-ում:դ Հեմատոքսիլինի և էոզինի (H&E) ներկման արդյունքներ տասներկումատնյա աղիքի հիստոպաթոլոգիայի.Կարմիր սլաքները ցույց են տալիս վիլլիի վնասը, կանաչ սլաքները ցույց են տալիս կրիպտների վնասը:Սանդղակի սանդղակ՝ 100 մկմ:ե, զ Տասներկումատնյա աղիքների բարձրության և մկնիկի կրիպտի բարձրության վիճակագրական վերլուծություն:Աստղանիշները ցույց են տալիս էական տարբերություններ *P<0,05 և **P<0,01:Արդյունքները վերցված են 7 անկախ կենսաբանական փորձերից։BW, մարմնի քաշը;ig, ներգաստրային առաքման ուղի;ip, intraperitoneal առաքման ուղի;ns, ոչ էական (P > 0.05);PBS, ֆոսֆատ բուֆերացված ֆիզիոլոգիական լուծույթ;WT, վայրի տեսակ
IL-1β-ի սեկրեցումը բորբոքման ակտիվացման բնորոշ նշան է:Որոշելու համար, թե արդյոք G. duodenalis ալֆա-2 giardine-ը և alpha-7.3 giardine-ն ակտիվացնում են NLRP3 հյուրընկալող բորբոքվածությունը in vivo-ում, մենք օգտագործեցինք չբուժված WT մկներ (շամաթիվ խումբ) և NLRP3 բորբոքումով արգելափակված մկներ (MCC950 արգելակված բուժման խումբ):Փորձի մանրամասն սխեման ներկայացված է Նկար 4ա-ում:Փորձարարական խմբերը բաղկացած էին մկներից, որոնք բուժվել են PBS-ով, G. duodenalis կիստի բուժումը գավաթով, pcDNA3.1-ի միջմկանային ներարկում և pcDNA3.1(+)-ալֆա-2 գիարդինի կամ pcDNA3.1-ալֆա-7.3 գիարդինի միջմկանային ներարկում:Ռեկոմբինանտ պլազմիդի միջմկանային ընդունումից հետո 7-րդ օրը հավաքվել է շիճուկ և որոշվել է IL-1β-ի մակարդակը յուրաքանչյուր խմբում:Ինչպես ցույց է տրված Նկար 4b-ում, MOCK խմբում. (i) համեմատած PBS խմբի հետ, pcDNA3.1 բուժումը էական ազդեցություն չի ունեցել IL-1β սեկրեցիայի վրա (ANOVA, F(4.29)=4.062, P=0.9998), այնուամենայնիվ, IL-β սեկրեցումը զգալիորեն բարձրացել է G. duodenalis կիստա խմբում (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.0002), (ii) pcDNA3.1-alpha-2 giardine և pcDNA3:1- Ալֆա-7.3 գիարդինի ներմկանային ներարկումը զգալիորեն բարձրացրել է շիճուկում IL-1β մակարդակը (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P<0.0001);(iii) pcDNA3.1-ալֆա-7,3 giardine-ն առաջացրել է IL-1β սեկրեցիայի բարձր մակարդակներ pcDNA3.1-alpha-2 giardine ներմկանային ներարկման խմբում (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.0333) .MCC950 բուժման խմբի և MOCK խմբի յուրաքանչյուր խմբի համեմատ. (i) IL-1β սեկրեցիայի մակարդակները PBS վերահսկիչ խմբում և pcDNA3.1 վերահսկիչ խմբում որոշ չափով նվազել են MCC950 ինհիբիտորը արգելափակելուց հետո, սակայն տարբերությունը չի եղել: նշանակալի (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.4912 pcDNA3.1: ANOVA, F(9, 58) = 3.540, P = 0.5949);(ii) MCC950 արգելափակումից հետո:, IL-1β սեկրեցումը զգալիորեն կրճատվել է G. duodenalis կիստա վարակված խմբում, pcDNA3.1-alpha-2 giardine խմբում և pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine խմբում (G. duodenalis. ANOVA, F(9): , 58) = 3.540, P = 0.0120 pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(9, 58) = 3.540, P = 0.0447 pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(; ) = 3,540, P = 0,0164):Այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ ալֆա-2 գիարդինը և ալֆա-7.3 գիարդինը միջնորդում են NLRP3 բորբոքման ակտիվացումը in vivo-ում:
pcDNA3.1 (+)-giardines ակտիվացնում է NLRP3 հյուրընկալող բորբոքում in vivo:Մկները իմունիզացվել են (IM) ռեկոմբինանտ էուկարիոտիկ էքսպրեսիայի պլազմիդ pcDNA3.1(+)-ալֆա-2 գիարդինով կամ pcDNA3.1(+)-ալֆա-7.3 գիարդինով և այնուհետև բուժվել MCC950-ով (IP; MCC950 խումբ) կամ ոչ (կեղծ խումբ): ).PBS կամ pcDNA3.1(+) պլազմիդի բուժման խումբը օգտագործվել է որպես բացասական հսկողություն, G. duodenalis կիստաների բուժման խումբը՝ որպես դրական հսկողություն:Փորձարարական խումբ և բուժման ռեժիմ.բ IL-1β-ի շիճուկ մակարդակները մկների մեջ չափվել են 7-րդ օրը ELISA վերլուծության միջոցով:MOCK խմբում խմբերի միջև եղած տարբերությունները վերլուծվել են միակողմանի ANOVA-ի միջոցով, իսկ MOCK խմբի և MCC950 խմբի միջև եղած տարբերությունները վերլուծվել են SPSS ծրագրաշարի 22.0 տարբերակի t-թեստի միջոցով:Աստղանիշները ցույց են տալիս զգալի տարբերություններ բուժման խմբերի միջև MOCK խմբում, *P<0.05 և ***P<0.001;դոլարի նշանները ($) ցույց են տալիս էական տարբերություններ յուրաքանչյուր խմբի միջև MOCK խմբի և MCC950 խմբի միջև P<0.05-ում:Յոթ անկախ կենսաբանական փորձերի արդյունքներ.i, միջմկանային ներարկում, ns, ոչ էական (P > 0.05)
Ալֆա-2 և ալֆա-7.3 giardine միջնորդավորված NLRP3 հյուրընկալող բորբոքային ակտիվացման ազդեցությունը G. duodenalis վարակիչության վրա ուսումնասիրելու համար մենք օգտագործեցինք WT C57BL/6 մկներ և ներարկեցինք ալֆա-2 գիարդին և ալֆա-7.3 գիարդին:պլազմիդը ներարկվել է ներմկանային ճանապարհով, 3 օր հետո G. duodenalis կիստի ստամոքսային խողովակով, որից հետո մկներին 7 օր դիտարկել են:Փորձի մանրամասն սխեման ներկայացված է Նկար 5ա-ում:Յուրաքանչյուր մկան մարմնի քաշը չափվում էր ամեն օր, ընդունումից հետո 7-րդ օրը ստամոքսային խողովակի միջոցով հավաքվում էին տասներկումատնյա աղիքի թարմ հյուսվածքի նմուշներ, չափվում էին տրոֆոզոիտների քանակը և նկատվում հիստոպաթոլոգիական փոփոխություններ:Ինչպես ցույց է տրված Նկար 5b-ում, կերակրման ժամանակի աճով, յուրաքանչյուր խմբի մկների BW-ն աստիճանաբար ավելացավ:Մկների ՄՏ-ն սկսել է նվազել G. duodenalis կիստաների ներգաստրային ընդունումից հետո 3-րդ օրը, իսկ հետո աստիճանաբար աճել:NLRP3 բորբոքման ակտիվացումը, որը առաջացել է ալֆա-2 գիարդինի և ալֆա7.3 գիարդինի միջմկանային ներարկումով, զգալիորեն թուլացրել է քաշի կորուստը մկների մոտ (1-ին օր. pcDNA3.1-ալֆա-2 գիարդին, ANOVA, F(4, 30) = 1.399, P. = 0 .9754 Օր 1. pcDNA3.1-ալֆա-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30)=1.399, P=0.9987 Օր 2. pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.3172, P = 0.9979 օր 2. pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.3172, P = 0.8409; 4, 30) = 0.8222, P = 0.0262 Օր 3. pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.8222, P = 0.0083 Օր 4. pcDNA3.1-alpha-2 , F(4, 30) = 0.5620, P = 0.0012, Օր 4. pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5620, P <0.0001, Օր 5. pcDNA3.1-alpha - 2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P <0.0001 Օր 5. pcDNA3.1-alpha -7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P <0.0001 Օր 6. pcDNA3. ալֆա-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.7154, P = 0.0012, Օր 6. pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.7154, P = 0.0006;Օր 7. pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P<0.0001 Օր 7. pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P <0,0001):Մակաբուծական բեռը գնահատվել է տասներկումատնյա աղիքում (նկ. 5c):Համեմատ չբուժված դրական հսկողության և դատարկ pcDNA3.1 վեկտորով ներարկված խմբի հետ, G. duodenalis տրոֆոզոիտների թիվը զգալիորեն կրճատվել է α-2 գիարդին և α-7,3 գիարդին ներարկված խմբերում (pcDNA3.1-ալֆա): -2 գիարդին` ԱՆՈՎԱ, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0002, pcDNA3,1-ալֆա-7,3 գիարդին` ԱՆՈՎԱ, F(3, 24) = 1,209, P<0,0001):Բացի այդ, giardine alfa-7.3-ն ավելի պաշտպանիչ էր մկների մոտ, քան giardine alfa-2 (ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P = 0.0081):HE-ի ներկման արդյունքները ներկայացված են նկ.5d–f.Ալֆա-2 գիարդին և ալֆա-7.3 գիարդին ներարկված մկների մոտ ավելի քիչ են եղել տասներկումատնյա աղիքի հյուսվածքի ախտահարումներ, որոնք դրսևորվում են վիլուսի վնասվածքով, համեմատած այն մկների հետ, որոնց ներարկվել է G. duodenalis և մկների հետ, որոնց ներարկվել է G. duodenalis դատարկ pcDNA3 վեկտորի հետ համատեղ: 1 Մեծացում:(pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0.0035 կամ P = 0.0068; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0,0028 կամ P = 0,0055) և կրիպտների կրճատված ատրոֆիա (pcDNA3.1-alpha-2 giardine. ANOVA, F(3, 24) = 1.470, P = 0.0264 կամ P = 0.0158; pcDNA3.1-alpha-2: NO3. , F(3, 24) = 1,470, P = 0,0371 կամ P = 0,0191):Այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ ալֆա-2 գիարդինը և ալֆա-7,3 գիարդինը նվազեցնում են G. duodenalis-ի վարակիչությունը՝ ակտիվացնելով NLRP3 ինֆլամմազոմը in vivo-ում:
pcDNA3.1(+)-giardins-ի դերը G. duodenalis վարակի մեջ:Մկները իմունիզացվեցին (IM) ռեկոմբինանտ էուկարիոտիկ էքսպրեսիայի պլազմիդներով pcDNA3.1(+)-ալֆա-2 giardine կամ pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine, ապա մարտահրավեր նետվեցին G. duodenalis կիստաներով (ig):PBS խումբը և pcDNA3.1(+) + տասներկումատնյա աղիքի կիստաների բուժման խումբը օգտագործվել է որպես բացասական հսկողության խմբեր, իսկ տասներկումատնյա աղիքի կիստի բուժման խումբը՝ որպես դրական հսկողության խումբ:Փորձարարական խումբ և բուժման ռեժիմ.b Բուժման տարբեր խմբերից յուրաքանչյուրի մկների ՄՏ-ն վերահսկվել է մարտահրավերից հետո 7 օր:Աստղանիշները ցույց են տալիս զգալի տարբերություններ G. duodenalis խմբի և pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine խմբի խմբերի միջև, *P <0.05, **P <0.01 և ***P <0.001;դոլարի նշանը ($) ցույց է տալիս G. duodenalis-ի յուրաքանչյուր խմբի և pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 jardine խմբի միջև զգալի տարբերություն, $$P<0.01 և $$$P<0.001:գ Մակաբուծական ծանրաբեռնվածությունը որոշվել է տասներկումատնյա աղիքի 1 մլ (3 սմ երկարությամբ) տասներկումատնյա աղիքի լվացման մեջ տրոֆոզոիտների քանակի հաշվարկով և արտահայտվել որպես մակաբույծների քանակ մեկ սմ տասներկումատնյա աղիքի վրա:G. duodenalis վարակի խմբի, pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine խմբի և pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine խմբի միջև եղած տարբերությունները վերլուծվել են միակողմանի ANOVA-ով՝ օգտագործելով SPSS ծրագրային տարբերակը 22.0:Աստղանիշները ցույց են տալիս զգալի տարբերություններ **P<0.01 և ***P<0.001:դ Հիստոպաթոլոգիական փոփոխություններ տասներկումատնյա աղիքի.Կարմիր սլաքները ցույց են տալիս վիլլիի վնասը, կանաչ սլաքները ցույց են տալիս կրիպտների վնասը:Սանդղակի սանդղակ՝ 100 մկմ:e, f Մկնիկի տասներկումատնյա աղիքների բարձրության (e) և կրիպտի բարձրության (f) վիճակագրական վերլուծություն:Գծապատկեր 1d-ի խմբերի միջև եղած տարբերությունները վերլուծվել են միակողմանի ANOVA-ով՝ օգտագործելով SPSS ծրագրային ապահովման 22.0 տարբերակը:Աստղանիշները ցույց են տալիս էական տարբերություններ *P<0,05 և **P<0,01:Յոթ անկախ կենսաբանական փորձերի արդյունքներ.ns, ոչ էական (P > 0.05)
Giardia duodenum-ը մարդկանց և այլ կաթնասունների հայտնի աղիքային մակաբույծ է, որն առաջացնում է ժայարդիոզ:2004 թվականին այն ընդգրկվել է ԱՀԿ-ի անտեսված հիվանդությունների նախաձեռնության մեջ՝ 6 տարվա ընթացքում իր բարձր տարածվածության պատճառով, հատկապես ցածր սոցիալ-տնտեսական կարգավիճակ ունեցող համայնքներում [32]:Բնածին իմունային համակարգը վճռորոշ դեր է խաղում G. duodenalis վարակի իմունային պատասխանում:Հաղորդվում է, որ մկների մակրոֆագները կլանում և սպանում են G. duodenalis-ը՝ ազատելով արտաբջջային թակարդներ [33]:Մեր նախորդ ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ G. duodenalis-ը՝ ոչ ինվազիվ արտաբջջային մակաբույծ, ակտիվացնում է p38 MAPK, ERK, NF-κB p65 և NLRP3 բորբոքային ազդանշանային ուղիները մկների մակրոֆագներում՝ հյուրընկալող բորբոքային պատասխանները կարգավորելու համար, և թողարկված GEV-ը կարող է ուժեղացնել այս գործընթացը:13], 24]։Այնուամենայնիվ, ճշգրիտ PAMP-ները, որոնք ներգրավված են NLRP3 բորբոքային կարգավորվող բորբոքման մեջ GEV-ում և NLRP3 բորբոքման դերը ջարդիազում, մնում են պարզաբանված:Այս երկու հարցերի վրա լույս սփռելու համար մենք կատարեցինք այս ուսումնասիրությունը:
NLRP3 բորբոքային համակարգը գտնվում է իմունային բջիջների ցիտոպլազմայում և կարող է ակտիվանալ տարբեր մասնիկներով, ինչպիսիք են միզաթթվի բյուրեղները, տոքսինները, բակտերիաները, վիրուսները և մակաբույծները:Բակտերիաների ուսումնասիրությունների ժամանակ տոքսինները ճանաչվել են որպես հիմնական PAMP-ներ, որոնք ակտիվացնում են բորբոքային սենսորները՝ հանգեցնելով բորբոքման և բջիջների մահվան [34]:Որոշ կառուցվածքային տարբեր տոքսիններ, ինչպիսիք են հեմոլիզինը Staphylococcus aureus-ից [35] և Escherichia coli [36], հեմոլիզին BL (HBL) էնտերոտոքսինից (NHE) [37], հրահրում են NLRP3 բորբոքման ակտիվացումը:Վիրուսային ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ վիրուսային սպիտակուցները, ինչպիսիք են SARS-COV-2 ծրարի (E) սպիտակուցը [38] և Զիկա վիրուսի NS5 սպիտակուցը [39], կարևոր PAMP-ներ են, որոնք ճանաչվում են NLRP3 ընկալիչի կողմից:Մակաբույծների ուսումնասիրություններում հաղորդվել է, որ շատ մակաբույծներ կապված են հյուրընկալող բորբոքային ակտիվացման հետ, ինչպիսիք են Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41] և Leishmania [42]:Խիտ հատիկավոր GRA35, GRA42 և GRA43 սպիտակուցները, որոնք կապված են Toxoplasma gondii-ի վիրուլենտության հետ, անհրաժեշտ են Lewis առնետների մակրոֆագներում պիրոպտոզի ինդուկցիայի համար [43]:Բացի այդ, Լեյշմանիայի որոշ ուսումնասիրություններ կենտրոնացել են NLRP3 բորբոքման մեջ ներգրավված առանձին մոլեկուլների վրա, ինչպիսիք են մակաբույծի մեմբրանի լիպոֆոսֆոգլիկանը [44] կամ ցինկի մետալոպրոտեազը [45]:Անեքսինանման ալֆա-գիարդինների ընտանիքի գեների շարքում ալֆա-1 գիարդինը պատվաստանյութի հավանական թեկնածու է, որը պաշտպանում է G. duodenalis-ից մկների մոդելում [18]:Մեր ուսումնասիրության ընթացքում մենք ընտրել ենք G. duodenalis վիրուլենտության գործոններ ալֆա-2 և ալֆա-7,3 գիարդիններ, որոնք յուրահատուկ են գիարդիայի համար, բայց համեմատաբար ավելի քիչ են հաղորդվում:Այս երկու թիրախային գեները կլոնավորվել են pcDNA3.1(+) էուկարիոտիկ արտահայտման համակարգի վեկտորում՝ բորբոքման ակտիվացման վերլուծության համար:
Մեր մկնիկի մոդելում կասպազի ճեղքված բեկորները ծառայում են որպես բորբոքային ակտիվացման մարկեր:Խթանումից հետո NLRP3-ը փոխազդում է ASC-ի հետ, հավաքագրում է պրոկասպազներ և առաջացնում ակտիվ կասպազներ, որոնք բաժանում են պրո-IL-1β և պրո-IL-18 հասուն IL-1β և IL-18, համապատասխանաբար -18:Բորբոքային կասպազները (կասպազներ-1, -4, -5 և -11) ցիստեին պրոթեզերոնների պահպանված ընտանիք են, որոնք կարևոր նշանակություն ունեն բնածին պաշտպանության համար և ներգրավված են բորբոքման և ծրագրավորված բջիջների մահվան մեջ [46]:Կասպազ-1-ն ակտիվանում է կանոնական ինֆլմազոմների միջոցով [47], մինչդեռ կասպազները-4, -5 և -11-ը ճեղքվում են ատիպիկ բորբոքումների ձևավորման ժամանակ [48]:Այս ուսումնասիրության մեջ մենք օգտագործեցինք մկների որովայնային մակրոֆագները որպես մոդել և հետազոտեցինք p20 caspase-1-ի ճեղքված կասպազա-1-ը որպես հյուրընկալող NLRP3 բորբոքման ակտիվացման մարկեր G. duodenalis վարակի ուսումնասիրություններում:Արդյունքները ցույց են տվել, որ շատ ալֆա-գիարդիններ պատասխանատու են բորբոքման բնորոշ ակտիվացման համար, ինչը համահունչ է բակտերիաների և վիրուսների մեջ ներգրավված հիմնական վիրուսային մոլեկուլների հայտնաբերմանը:Այնուամենայնիվ, մեր ուսումնասիրությունը միայն նախնական էկրան է, և կան այլ մոլեկուլներ, որոնք կարող են ակտիվացնել ոչ դասական բորբոքումները, քանի որ մեր նախորդ ուսումնասիրությունը հայտնաբերել է ինչպես դասական, այնպես էլ ոչ դասական բորբոքումներ G. duodenalis վարակի մեջ [13]:Հետագայում որոշելու համար, թե արդյոք գեներացված p20 կասպազա-1-ը կապված է NLRP3 բորբոքման հետ, մենք ալֆա-2 և ալֆա-7.3 գիարդինները փոխարկեցինք մկների որովայնային մակրոֆագների մեջ՝ որոշելու հիմնական մոլեկուլային սպիտակուցի արտահայտման մակարդակները և ASC օլիգոմերացման մակարդակները՝ հաստատելով, որ α-գիարդիններն էլ ակտիվանում են: բորբոքային NLRP3.Մեր արդյունքները փոքր-ինչ տարբերվում են Manko-Prykhoda et al.-ի արդյունքներից, ովքեր հայտնել են, որ Caco-2 բջիջների խթանումը միայն G. muris կամ E. coli EPEC շտամներով կարող է մեծացնել NLRP3, ASC և caspase-1 ֆլուորեսցենցիայի ինտենսիվությունը, թեև ոչ էականորեն, մինչդեռ ինչպես G. muris-ի և E. coli-ի համակցումը բարձրացրեց երեք սպիտակուցների մակարդակը [49]:Այս անհամապատասխանությունը կարող է պայմանավորված լինել Giardia տեսակների, բջջային գծերի և առաջնային բջիջների ընտրության տարբերություններով:Մենք նաև կատարել ենք in vivo անալիզներ՝ օգտագործելով MCC950 5 շաբաթական էգ WT C57BL/6 մկների մոտ, որոնք ավելի զգայուն են G. duodenalis-ի նկատմամբ:MCC950-ը հզոր և ընտրովի փոքր մոլեկուլային NLRP3 ինհիբիտոր է, որն արգելափակում է կանոնական և ոչ կանոնական NLRP3 ակտիվացումը նանոմոլային կոնցենտրացիաներում:MCC950-ն արգելակում է NLRP3 ակտիվացումը, բայց չի ազդում AIM2, NLRC4 և NLRP1 բորբոքային ուղիների կամ TLR ազդանշանային ուղիների ակտիվացման վրա [27]:MCC950-ն արգելափակում է NLRP3-ի ակտիվացումը, սակայն չի արգելակում NLRP3-ի մեկնարկը, K+ արտահոսքը, Ca2+ ներհոսքը կամ NLRP3-ի և ASC-ի փոխազդեցությունը.փոխարենը, այն արգելակում է NLRP3 բորբոքային ակտիվացումը՝ արգելափակելով ASC օլիգոմերացումը [27]:Հետևաբար, մենք օգտագործեցինք MCC950 in vivo հետազոտության մեջ՝ որոշելու համար NLRP3 բորբոքման դերը գիարդինի ներարկումից հետո:Ակտիվացված կասպազա-1 p10-ը բաժանում է պրո-ԻԼ-1β և պրո-ԻԼ-18 պրո-բորբոքային ցիտոկինները հասուն IL-1β-ի և IL-18-ի [50]:Այս ուսումնասիրության մեջ շիճուկ IL-1β մակարդակները giardine-ով բուժված մկների մոտ MCC950-ով կամ առանց դրա օգտագործվել են որպես NLRP3 բորբոքման ակտիվացման ցուցիչ:Ինչպես և սպասվում էր, MCC950 բուժումը զգալիորեն նվազեցրեց շիճուկ IL-1β մակարդակը:Այս տվյալները հստակ ցույց են տալիս, որ G. duodenalis giardin alfa-2-ը և giardin alfa-7.3-ն ի վիճակի են ակտիվացնել NLRP3 մկնիկի բորբոքումը:
Վերջին տասնամյակում կուտակված զգալի տվյալները ցույց են տվել, որ IL-17A-ն իմունիտետի գլխավոր կարգավորիչն է G. muris-ի դեմ՝ հրահրելով IL-17RA ազդանշան, արտադրելով հակամանրէային պեպտիդներ և կարգավորելով կոմպլեմենտի ակտիվացումը [51]:Այնուամենայնիվ, Giardia վարակն ավելի հաճախ հանդիպում է երիտասարդ չափահասների մոտ, և հաղորդվել է, որ Giardia վարակը երիտասարդ մկների մոտ չի ակտիվացնում IL-17A պատասխանը՝ իր պաշտպանիչ ազդեցությունը գործադրելու համար [52], ինչը հետազոտողներին դրդում է փնտրել այլ իմունոմոդուլացնող Giardia:Հելմինտային վարակի մեխանիզմները.Վերջերս կատարված ուսումնասիրության հեղինակները հայտնել են, որ G. muris-ը կարող է ակտիվացնել NLRP3 բորբոքվածությունը E. coli EPEC-ի կողմից, որը նպաստում է հակամանրէային պեպտիդների արտադրությանը և նվազեցնում դրա կցման կարողությունը և տրոֆոզոիտների քանակը աղիքային տրակտում՝ դրանով իսկ նվազեցնելով հաստ աղիքի ծանրությունը: հիվանդություններ, որոնք առաջանում են բացիլներով [49]:NLRP3 inflammasome-ը մասնակցում է տարբեր հիվանդությունների զարգացմանը:Ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ Pseudomonas aeruginosa-ն մակրոֆագներում առաջացնում է աուտոֆագիա՝ բջիջների մահից խուսափելու համար, և այս գործընթացը կախված է NLRP3 բորբոքման ակտիվացումից [53]:N. caninum-ի համար NLRP3 բորբոքային թթվածնի ռեակտիվ տեսակների միջոցով ակտիվացումը սահմանափակում է դրա վերարտադրությունը տանտիրոջ մեջ՝ դարձնելով այն պոտենցիալ թերապևտիկ թիրախ [9]:Պարզվել է, որ Paracoccidioides brasiliensis-ը հրահրում է NLRP3 բորբոքման ակտիվացումը մկների ոսկրածուծից ստացված դենդրիտային բջիջներում, ինչը հանգեցնում է բորբոքային IL-1β ցիտոկինի ազատմանը, որը կարևոր դեր է խաղում հյուրընկալողի պաշտպանության գործում [10]:Լեյշմանիայի մի քանի տեսակներ, ներառյալ L. amazonensis, L. major, L. braziliensis և L. infantum chagasi, ակտիվացնում են NLRP3 և ASC-կախյալ կասպազ-1-ը մակրոֆագներում, ինչպես նաև Լեյշմանիա վարակը:Մակաբույծների բազմացումը ուժեղացված է NLRP3/ASC/caspase-1 գենի պակաս ունեցող մկների մոտ [11]:Zamboni et al.Հաղորդվում է, որ լեյշմանիա վարակը հրահրում է մակրոֆագներում NLRP3 բորբոքման ակտիվացումը, ինչը սահմանափակում է մակաբույծների ներբջջային բազմացումը:Այսպիսով, Լեյշմանիան կարող է արգելակել NLRP3 ակտիվացումը՝ որպես խուսափելու ռազմավարություն:In vivo ուսումնասիրություններում NLRP3 բորբոքվածությունը նպաստեց Լեյշմանիայի վերացմանը, բայց չազդեց հյուսվածքների վրա [54]:Ընդհակառակը, հելմինտիազի ուսումնասիրություններում NLRP3 բորբոքման ակտիվացումը ճնշում է հյուրընկալողի պաշտպանիչ իմունիտետը ստամոքս-աղիքային հելմինտիազի դեմ [12]:Շիգելլան ամբողջ աշխարհում փորլուծություն առաջացնող հիմնական բակտերիաներից մեկն է:Այս բակտերիաները կարող են առաջացնել IL-1β արտադրություն P2X7 ընկալիչների միջնորդավորված K+ արտահոսքի, ռեակտիվ թթվածնի տեսակների, լիզոսոմային թթվայնացման և միտոքոնդրիումային վնասների միջոցով:NLRP3 ինֆլմազոմը բացասաբար է կարգավորում ֆագոցիտոզը և մակրոֆագների բակտերիալ ակտիվությունը շիգելլայի դեմ [55]:Պլազմոդիումի ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ պլազմոդիումով վարակված AIM2, NLRP3 կամ կասպազա-1 անբավարար մկները արտադրում են 1-ին տիպի ինտերֆերոնի բարձր մակարդակներ և ավելի դիմացկուն են պլազմոդիումի վարակի նկատմամբ [56]:Այնուամենայնիվ, ալֆա-2 գիարդինի և ալֆա-7.3 գիարդինի դերը մկների մոտ NLRP3 բորբոքման պաթոգեն ակտիվացման գործում անհասկանալի է:
Այս հետազոտության մեջ MCC950-ի կողմից NLRP3 բորբոքման արգելակումը նվազեցրեց BW-ն և ավելացրեց տրոֆոզոիտների քանակը աղիքային լվացման հեղուկում մկների մոտ, ինչը հանգեցնում է տասներկումատնյա աղիքի հյուսվածքի ավելի ծանր պաթոլոգիական փոփոխությունների:Ալֆա-2 գիարդինը և ալֆա-7.3 գիարդինը ակտիվացնում են հյուրընկալող մկան NLRP3 բորբոքումը, մեծացնում են մկան մարմնի քաշը, նվազեցնում են տրոֆոզոիտների քանակը աղիքային լվացման հեղուկում և թեթևացնում են տասներկումատնյա աղիքի պաթոլոգիական վնասվածքները:Այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ G. duodenalis-ը կարող է ակտիվացնել NLRP3 հյուրընկալող բորբոքումը ալֆա-2 գիարդինի և ալֆա-7,3 գիարդինի միջոցով՝ նվազեցնելով G. duodenalis-ի ախտածինությունը մկների մոտ:
Միասնաբար, մեր արդյունքները ցույց են տալիս, որ ալֆա-2 և ալֆա-7.3 գիարդինները հրահրում են NLRP3 հյուրընկալող բորբոքման ակտիվացումը և նվազեցնում G. duodenalis-ի վարակիչությունը մկների մոտ:Հետեւաբար, այս մոլեկուլները խոստումնալից թիրախներ են գարդիազի կանխարգելման համար:
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM:Giardiasis. ակնարկ.Վերջերս պարզվեց, որ Փեթ Ինֆլամը ալերգիկ է դեղերից:2019; 13:134–43.
Էսկոբեդո Ա.Ա., Ցիմերման Ս. Ջիարդիասիս. դեղաբուժության ակնարկ:Դեղագործի փորձագիտական ​​կարծիքը.2007 թ.8: 1885–902 թթ.
Թիան Հուաֆենգ, Չեն Բին, Վեն Ցզյանֆենգ։Giardiasis, դեղերի դիմադրություն և նոր թիրախների հայտնաբերում.Վարակում է Disord դեղամիջոցի թիրախները:2010; 10:295–302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T և այլն: NLRP3 բորբոքային և բորբոքային հիվանդություններ:Oxide Med Cell Longev.2020; 2020: 4063562.
Chen GY, Núñez G. Inflammasome-ի դերը աղիքային բորբոքման և քաղցկեղի մեջ:Գաստրոէնտերոլոգիա.2011 թ.141:1986–99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Կանոնական և ատիպիկ NLRP3 բորբոքային ակտիվացում իմունային հանդուրժողականության և աղիքների բորբոքման խաչմերուկում:նախաիմունային.2017; 8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S, et al.ROS-ի միջնորդավորված NLRP3 բորբոքային ակտիվացումը ներգրավված է ի պատասխան N. caninum վարակի:Մակաբույծ վեկտոր.2020; 13:449.