Շնորհակալություն Nature.com այցելելու համար:Ձեր օգտագործած բրաուզերի տարբերակը ունի սահմանափակ CSS աջակցություն:Լավագույն փորձի համար խորհուրդ ենք տալիս օգտագործել թարմացված դիտարկիչ (կամ անջատել Համատեղելիության ռեժիմը Internet Explorer-ում):Միևնույն ժամանակ, շարունակական աջակցությունն ապահովելու համար մենք կայքը կներկայացնենք առանց ոճերի և JavaScript-ի:
Թոքային կիստոզային ֆիբրոզի բուժման գենային վեկտորները պետք է ուղղված լինեն հաղորդիչ շնչուղիներին, քանի որ ծայրամասային թոքերի փոխարկումը չունի թերապևտիկ ազդեցություն:Վիրուսային փոխակերպման արդյունավետությունը ուղղակիորեն կապված է կրիչի բնակության ժամանակի հետ:Այնուամենայնիվ, առաքման հեղուկները, ինչպիսիք են գեների կրիչները, բնականաբար ցրվում են ալվեոլների մեջ ինհալացիայի ժամանակ, և ցանկացած ձևի բուժական մասնիկները արագորեն հեռացվում են լորձաթաղանթային տրանսպորտի միջոցով:Շնչառական ուղիներում գեների կրիչների բնակության ժամկետի երկարաձգումը կարևոր է, բայց դժվար է հասնել:Կրիչի հետ կապված մագնիսական մասնիկները, որոնք կարող են ուղղվել դեպի շնչուղիների մակերեսը, կարող են բարելավել տարածաշրջանային թիրախավորումը:In vivo պատկերավորման հետ կապված խնդիրների պատճառով նման փոքր մագնիսական մասնիկների վարքագիծը շնչուղիների մակերեսին կիրառական մագնիսական դաշտի առկայության դեպքում վատ է հասկացվում:Այս հետազոտության նպատակն էր օգտագործել սինքրոտրոնային պատկերացում՝ in ​​vivo-ում պատկերացնելու համար մի շարք մագնիսական մասնիկների շարժումը անզգայացված առնետների շնչափողում, որպեսզի ուսումնասիրեն միայնակ և զանգվածային մասնիկների վարքի դինամիկան և օրինաչափությունները in vivo-ում:Այնուհետև մենք նաև գնահատեցինք, թե արդյոք լենտիվիրուսային մագնիսական մասնիկների առաքումը մագնիսական դաշտի առկայության դեպքում կբարձրացնի առնետի շնչափողում փոխակերպման արդյունավետությունը:Սինքրոտրոնային ռենտգեն պատկերումը ցույց է տալիս մագնիսական մասնիկների վարքը անշարժ և շարժվող մագնիսական դաշտերում in vitro և in vivo:Մասնիկները չեն կարող հեշտությամբ քաշվել կենդանի շնչուղիների մակերևույթով՝ օգտագործելով մագնիսներ, սակայն տեղափոխման ընթացքում նստվածքները կենտրոնանում են տեսադաշտում, որտեղ մագնիսական դաշտն ամենաուժեղն է:Փոխանցման արդյունավետությունը նույնպես վեց անգամ ավելացավ, երբ լենդվիրուսային մագնիսական մասնիկները փոխանցվեցին մագնիսական դաշտի առկայության դեպքում:Միասին այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ լենտիվիրուսային մագնիսական մասնիկները և մագնիսական դաշտերը կարող են արժեքավոր մոտեցումներ լինել՝ բարելավելու գենային վեկտորի թիրախավորումը և փոխակերպման մակարդակները հաղորդիչ շնչուղիներում in vivo-ում:
Կիստիկական ֆիբրոզը (CF) առաջանում է մեկ գենի տատանումների պատճառով, որը կոչվում է CF տրանսմեմբրանային հաղորդունակության կարգավորիչ (CFTR):CFTR սպիտակուցը իոնային ալիք է, որն առկա է էպիթելային բազմաթիվ բջիջներում ամբողջ մարմնում, ներառյալ շնչուղիները, որոնք հանդիսանում են կիստոզային ֆիբրոզի պաթոգենեզի հիմնական տեղամասը:CFTR-ի թերությունները հանգեցնում են ջրի աննորմալ տեղափոխման, շնչուղիների մակերեսի ջրազրկման և շնչուղիների մակերեսային հեղուկ շերտի (ASL) խորության նվազմանը:Այն նաև խաթարում է լորձաթաղանթային տրանսպորտի (MCT) համակարգի կարողությունը՝ մաքրելու շնչուղիները ներշնչվող մասնիկներից և պաթոգեններից:Մեր նպատակն է մշակել lentiviral (LV) գենային թերապիա՝ ապահովելու CFTR գենի ճիշտ պատճենը և բարելավելու ASL, MCT և թոքերի առողջությունը, և շարունակել զարգացնել նոր տեխնոլոգիաներ, որոնք կարող են չափել այս պարամետրերը in vivo1-ում:
LV վեկտորները կիստիկական ֆիբրոզի գենային թերապիայի առաջատար թեկնածուներից են, հիմնականում այն ​​պատճառով, որ նրանք կարող են մշտապես ինտեգրել թերապևտիկ գենը շնչուղիների բազալ բջիջների մեջ (շնչուղիների ցողունային բջիջներ):Սա կարևոր է, քանի որ դրանք կարող են վերականգնել նորմալ խոնավացումը և լորձի մաքրումը` տարբերակվելով օդուղիների մակերևույթի ֆունկցիոնալ գեներով շտկված բջիջների, որոնք կապված են կիստիկ ֆիբրոզի հետ, ինչը հանգեցնում է ողջ կյանքի ընթացքում օգուտների:LV վեկտորները պետք է ուղղված լինեն հաղորդիչ շնչուղիների դեմ, քանի որ այստեղից է սկսվում թոքերի ներգրավվածությունը CF-ում:Վեկտորի առաքումը թոքերի մեջ ավելի խորը կարող է հանգեցնել ալվեոլային փոխակերպման, սակայն դա թերապևտիկ ազդեցություն չունի կիստիկ ֆիբրոզի դեպքում:Այնուամենայնիվ, այնպիսի հեղուկներ, ինչպիսիք են գեների կրիչները, բնականաբար ներգաղթում են ալվեոլներ, երբ ներշնչվում են ծննդաբերությունից հետո3,4 և բուժական մասնիկները արագորեն դուրս են մղվում բերանի խոռոչ MCT-ների միջոցով:LV փոխակերպման արդյունավետությունը ուղղակիորեն կապված է այն ժամանակի հետ, երբ վեկտորը մնում է թիրախային բջիջներին մոտ, որպեսզի թույլ տա բջջային կլանումը.Կիստիկական ֆիբրոզի դեպքում շնչուղիներում LV-ի նստեցման ժամանակը երկարացնելու ունակությունը կարևոր է այս ոլորտում փոխազդեցության բարձր մակարդակի հասնելու համար, սակայն մինչ այժմ դժվար է եղել:
Այս խոչընդոտը հաղթահարելու համար մենք առաջարկում ենք, որ LV մագնիսական մասնիկները (MPs) կարող են օգնել երկու փոխլրացնող եղանակներով:Նախ, նրանք կարող են մագնիսով ուղղորդվել դեպի օդուղիների մակերեսը, որպեսզի բարելավեն թիրախավորումը և օգնեն գեների կրիչի մասնիկներին լինել շնչուղիների ճիշտ տարածքում.և ASL) տեղափոխվում են բջիջների շերտ 6: Պատգամավորները լայնորեն օգտագործվում են որպես թիրախային դեղերի առաքման միջոցներ, երբ դրանք կապվում են հակամարմինների, քիմիաթերապիայի դեղամիջոցների կամ այլ փոքր մոլեկուլների հետ, որոնք կցվում են բջջային թաղանթներին կամ կապվում են իրենց համապատասխան բջջային մակերեսի ընկալիչներին և կուտակվում են ուռուցքային տեղամասերում: ստատիկ էլեկտրականության առկայությունը.Մագնիսական դաշտերը քաղցկեղի թերապիայի համար 7. Այլ «հիպերթերմիկ» մեթոդներն ուղղված են ուռուցքային բջիջները սպանելուն՝ տաքացնելով պատգամավորները, երբ ենթարկվում են տատանվող մագնիսական դաշտերի:Մագնիսական տրանսֆեկցիայի սկզբունքը, որում մագնիսական դաշտը օգտագործվում է որպես տրանսֆեկցիոն միջոց՝ ԴՆԹ-ի փոխանցումը բջիջներ ուժեղացնելու համար, սովորաբար օգտագործվում է in vitro՝ օգտագործելով մի շարք ոչ վիրուսային և վիրուսային գենային վեկտորներ՝ դժվար փոխակերպվող բջջային գծերի համար։ ..Ստատիկ մագնիսական դաշտի առկայության դեպքում LV մագնիտոտրրանսֆեկցիայի արդյունավետությունը LV MP-ի առաքմամբ մարդու բրոնխիալ էպիթելի բջջային գիծ է հաստատվել՝ 186 անգամ մեծացնելով փոխակերպման արդյունավետությունը՝ համեմատած միայն LV վեկտորի հետ:LV MT-ը կիրառվել է նաև կիստիկական ֆիբրոզի in vitro մոդելի վրա, որտեղ մագնիսական տրանսֆեկցիան ավելացրել է LV փոխակերպումը օդ-հեղուկ միջերեսային մշակույթներում 20 գործակցով` կիստոզային ֆիբրոզի խորխի առկայության դեպքում10:Այնուամենայնիվ, in vivo օրգանների մագնիսատրանսֆեկցիան համեմատաբար քիչ ուշադրության է արժանացել և գնահատվել է միայն մի քանի կենդանիների ուսումնասիրություններում11,12,13,14,15, հատկապես թոքերի16,17:Այնուամենայնիվ, կիստոզային ֆիբրոզում թոքերի թերապիայի մագնիսական տրանսֆեկցիայի հնարավորությունները պարզ են:Թանը և այլք:(2020 թ.) հայտարարել է, որ «մագնիսական նանոմասնիկների արդյունավետ թոքային առաքման վերաբերյալ վավերացման ուսումնասիրությունը ճանապարհ կհարթի ապագա CFTR ինհալացիոն ռազմավարությունների համար՝ բարելավելու կլինիկական արդյունքները կիստիկ ֆիբրոզով հիվանդների մոտ»6:
Փոքր մագնիսական մասնիկների վարքագիծը շնչառական ուղիների մակերեսին կիրառական մագնիսական դաշտի առկայության դեպքում դժվար է պատկերացնել և ուսումնասիրել, և, հետևաբար, դրանք վատ են հասկացվում:Այլ ուսումնասիրություններում մենք մշակել ենք սինքրոտրոնային տարածման վրա հիմնված ֆազային կոնտրաստ ռենտգեն պատկերման մեթոդ (PB-PCXI) ոչ ինվազիվ պատկերման և ASL18 խորության և MCT19 վարքագծի րոպեական in vivo փոփոխությունների քանակականացման համար,20՝ ուղղակիորեն չափելու գազի ալիքի մակերեսի խոնավացումը։ և օգտագործվում է որպես բուժման արդյունավետության վաղ ցուցիչ:Բացի այդ, մեր MCT գնահատման մեթոդը օգտագործում է 10–35 մկմ տրամագծով մասնիկներ՝ կազմված կավահողից կամ բարձր բեկման ինդեքսով ապակուց՝ որպես MCT մարկերներ, որոնք տեսանելի են PB-PCXI21-ով:Երկու մեթոդներն էլ հարմար են մասնիկների մի շարք տեսակների, ներառյալ պատգամավորների պատկերման համար:
Բարձր տարածական և ժամանակային լուծաչափի շնորհիվ մեր PB-PCXI-ի վրա հիմնված ASL և MCT անալիզները հարմար են առանձին և զանգվածային մասնիկների դինամիկան և վարքային օրինաչափությունները in vivo ուսումնասիրելու համար՝ օգնելու մեզ հասկանալ և օպտիմալացնել MP գեների փոխանցման մեթոդները:Մոտեցումը, որը մենք օգտագործում ենք այստեղ, հիմնված է մեր ուսումնասիրությունների վրա՝ օգտագործելով SPring-8 BL20B2 ճառագայթային գիծը, որում մենք տեսողականորեն պատկերացրել ենք հեղուկի շարժումը մկների քթի և թոքային շնչուղիներում կեղծ վեկտորի չափաբաժնի առաքումից հետո՝ օգնելու բացատրել մեր նկատված տարասեռ գենային արտահայտման օրինաչափությունները: մեր գենում.կենդանիների ուսումնասիրություններ 3.4 կրիչի չափաբաժնով:
Այս հետազոտության նպատակն էր օգտագործել PB-PCXI սինքրոտրոնը՝ կենդանի առնետների շնչափողում մի շարք պատգամավորների in vivo շարժումները պատկերացնելու համար:Այս PB-PCXI պատկերային հետազոտությունները նախագծված էին MP շարքը, մագնիսական դաշտի ուժգնությունը և գտնվելու վայրը ստուգելու համար՝ որոշելու դրանց ազդեցությունը MP շարժման վրա:Մենք ենթադրում էինք, որ արտաքին մագնիսական դաշտը կօգնի առաքված MF-ին մնալ կամ տեղափոխվել թիրախային տարածք:Այս ուսումնասիրությունները նաև թույլ տվեցին մեզ որոշել մագնիսների կոնֆիգուրացիաները, որոնք առավելագույնի են հասցնում շնչափողում մնացած մասնիկների քանակը նստվածքից հետո:Ուսումնասիրությունների երկրորդ շարքում մենք նպատակ ունեինք օգտագործել այս օպտիմալ կոնֆիգուրացիան՝ ցուցադրելու փոխակերպման օրինաչափությունը, որը բխում է առնետների շնչուղիներին LV-MP-ների in vivo առաքումից՝ ենթադրելով, որ LV-MP-ների առաքումը շնչուղիների թիրախավորման համատեքստում կհանգեցնի: LV փոխակերպման արդյունավետության բարձրացում:.
Կենդանիների հետ կապված բոլոր ուսումնասիրություններն իրականացվել են Ադելաիդայի համալսարանի (M-2019-060 և M-2020-022) և SPring-8 սինքրոտրոնային կենդանիների էթիկայի հանձնաժողովի կողմից հաստատված արձանագրությունների համաձայն:Փորձերն իրականացվել են ARRIVE-ի առաջարկությունների համաձայն։
Բոլոր ռենտգենյան պատկերներն արվել են BL20XU ճառագայթային գծում SPring-8 սինքրոտրոնում Ճապոնիայում՝ օգտագործելով նախկինում նկարագրվածի նման կարգավորումը21,22:Մի խոսքով, փորձնական տուփը գտնվում էր սինքրոտրոնային պահեստավորման օղակից 245 մ հեռավորության վրա:Նմուշից դետեկտոր հեռավորությունը 0,6 մ է օգտագործվում մասնիկների պատկերման ուսումնասիրությունների համար և 0,3 մ՝ in ​​vivo պատկերավորման ուսումնասիրությունների համար՝ ֆազային հակադրության էֆեկտներ ստեղծելու համար:Օգտագործվել է 25 կՎ էներգիայով միագույն ճառագայթ։Պատկերները ստացվել են բարձր լուծաչափով ռենտգեն փոխարկիչի միջոցով (SPring-8 BM3)՝ զուգակցված sCMOS դետեկտորի հետ:Փոխակերպիչը ռենտգենյան ճառագայթները փոխակերպում է տեսանելի լույսի, օգտագործելով 10 մկմ հաստությամբ սցինտիլյատոր (Gd3Al2Ga3O12), որն այնուհետև ուղղվում է դեպի sCMOS սենսոր՝ օգտագործելով ×10 (NA 0.3) մանրադիտակի օբյեկտը:SCMOS դետեկտորը Orca-Flash4.0-ն էր (Hamamatsu Photonics, Japanապոնիա)՝ 2048 × 2048 պիքսել զանգվածով և 6,5 × 6,5 մկմ պիքսել չմշակված չափերով:Այս պարամետրը տալիս է 0,51 մկմ արդյունավետ իզոտրոպ պիքսելի չափ և մոտավորապես 1,1 մմ × 1,1 մմ տեսադաշտ:100 ms ազդեցության տևողությունը ընտրվել է օդուղիների ներսում և դրսում մագնիսական մասնիկների ազդանշան-աղմուկ հարաբերակցությունը առավելագույնի հասցնելու համար՝ միաժամանակ նվազագույնի հասցնելով շնչառության հետևանքով առաջացած շարժման արտեֆակտները:In vivo հետազոտությունների համար ռենտգենյան ճառագայթների ուղու վրա տեղադրվել է արագ ռենտգեն կափարիչ՝ ճառագայթման չափաբաժինը սահմանափակելու համար՝ արգելափակելով ռենտգենյան ճառագայթը ճառագայթների միջև:
LV կրիչները չեն օգտագործվել SPring-8 PB-PCXI պատկերային հետազոտություններում, քանի որ BL20XU պատկերազարդման խցիկը կենսաանվտանգության մակարդակ 2-ի հավաստագրված չէ:Փոխարենը, մենք ընտրեցինք մի շարք լավ բնութագրված պատգամավորներ երկու առևտրային վաճառողներից, որոնք ընդգրկում էին մի շարք չափսեր, նյութեր, երկաթի կոնցենտրացիաներ և կիրառություններ. կենդանի շնչուղիներ.մակերեւույթ։MP-ի չափը տատանվում է 0,25-ից մինչև 18 մկմ և պատրաստված է տարբեր նյութերից (տես Աղյուսակ 1), սակայն յուրաքանչյուր նմուշի կազմը, ներառյալ MP-ում մագնիսական մասնիկների չափը, անհայտ է:Ելնելով մեր լայնածավալ MCT ուսումնասիրություններից՝ 19, 20, 21, 23, 24, մենք ակնկալում ենք, որ մինչև 5 մկմ երկարությամբ MP-ներ կարող են տեսնել շնչափողի շնչուղիների մակերեսին, օրինակ՝ հանելով հաջորդական շրջանակները՝ MP-ի շարժման բարելավված տեսանելիությունը տեսնելու համար:0,25 մկմ մեկ MP-ն ավելի փոքր է, քան պատկերային սարքի թույլատրելիությունը, սակայն ակնկալվում է, որ PB-PCXI-ը կհայտնաբերի դրանց ծավալային հակադրությունը և մակերևութային հեղուկի շարժումը, որի վրա դրանք նստած են նստելուց հետո:
Աղյուսակում ներկայացված յուրաքանչյուր պատգամավորի համար նմուշներ:1-ը պատրաստվել է 20 մկլ ապակե մազանոթներում (Drummond Microcaps, PA, USA) 0,63 մմ ներքին տրամագծով:Corpuscular մասնիկները հասանելի են ջրի մեջ, մինչդեռ CombiMag մասնիկները հասանելի են արտադրողի հատուկ հեղուկում:Յուրաքանչյուր խողովակ կիսով չափ լցված է հեղուկով (մոտ 11 µl) և տեղադրվում է նմուշի պահարանի վրա (տես Նկար 1):Ապակե մազանոթները համապատասխանաբար տեղադրվել են բեմի վրա՝ պատկերազարդման խցիկում և տեղադրվել հեղուկի եզրերին:Հազվագյուտ հողից, նեոդիմից, երկաթից և բորից (NdFeB) (N35, կատ. No. LM1652, Jaycar Electronics, Ավստրալիա) 1,17 Տ 1,17 Տ խտությամբ 19 մմ տրամագծով (28 մմ երկարությամբ) նիկելային թաղանթով մագնիս է ամրացվել։ առանձին փոխանցման աղյուսակ՝ հասնելու համար Հեռակա կարգով փոխեք ձեր դիրքը մատուցման ընթացքում:Ռենտգեն պատկերումը սկսվում է, երբ մագնիսը տեղադրվում է նմուշից մոտավորապես 30 մմ բարձրության վրա, և պատկերները ստացվում են վայրկյանում 4 կադր արագությամբ:Պատկերման ընթացքում մագնիսը մոտեցրեց ապակե մազանոթ խողովակին (մոտ 1 մմ հեռավորության վրա), այնուհետև տեղափոխվեց խողովակի երկայնքով՝ գնահատելու դաշտի ուժգնության և դիրքի ազդեցությունը:
In vitro պատկերավորման կարգավորում, որը պարունակում է MP նմուշներ ապակե մազանոթներում xy նմուշի թարգմանության փուլում:Ռենտգենյան ճառագայթի ուղին նշվում է կարմիր կետավոր գծով:
Երբ հաստատվեց պատգամավորների in vitro տեսանելիությունը, նրանց մի ենթախումբ փորձարկվեց in vivo վայրի տեսակի էգ Wistar ալբինոս առնետների վրա (~12 շաբաթական, ~200 գ):Մեդետոմիդին 0.24 մգ/կգ (Domitor®, Zenoaq, Japan), միդազոլամ 3.2 մգ/կգ (Dormicum®, Astellas Pharma, Ճապոնիա) և բուտորֆանոլ 4 մգ/կգ (Vetorphale®, Meiji Seika):Առնետներին անզգայացրել են Ֆարմա (Ճապոնիա) խառնուրդով ներպերիտոնեային ներարկումով:Անզգայացումից հետո նրանք պատրաստվել են պատկերազարդման՝ հեռացնելով շնչափողի շուրջը գտնվող մորթին, տեղադրելով էնդոտրախեալ խողովակ (ET; 16 Ga ներերակային կանուլա, Terumo BCT) և անշարժացնելով պառկած դիրքում՝ հատուկ պատրաստված պատկերազարդման ափսեի վրա, որը պարունակում է ջերմային պարկ: մարմնի ջերմաստիճանը պահպանելու համար.22. Այնուհետև պատկերազարդման ափսեը մի փոքր անկյան տակ կցվեց պատկերման տուփի նմուշի բեմին՝ շնչափողը ռենտգեն պատկերի վրա հորիզոնական հարթեցնելու համար, ինչպես ցույց է տրված Նկար 2ա-ում:
(ա) In vivo պատկերավորման կարգավորում SPring-8 պատկերագրման միավորում, ռենտգենյան ճառագայթի ուղին նշված է կարմիր կետավոր գծով:(բ, գ) Շնչափողի մագնիսների տեղայնացումը կատարվել է հեռակա կարգով` օգտագործելով երկու ուղղանկյուն տեղադրված IP տեսախցիկներ:Էկրանի վրա պատկերի ձախ կողմում դուք կարող եք տեսնել գլուխը պահող մետաղալարը և ET խողովակի ներսում տեղադրված առաքման շարանը:
Հեռակառավարվող ներարկիչի պոմպային համակարգը (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL)՝ օգտագործելով 100 մկլ ապակե ներարկիչ, միացված էր PE10 խողովակին (0.61 մմ OD, 0.28 մմ ID)՝ օգտագործելով 30 Ga ասեղ:Նշեք խողովակը, որպեսզի համոզվեք, որ ծայրը ճիշտ դիրքում է շնչափողում՝ էնդոտրախեալ խողովակը տեղադրելիս:Օգտագործելով միկրոպոմպ, ներարկիչի մխոցը հանվեց, և խողովակի ծայրը ընկղմվեց առաքվող MP նմուշի մեջ:Այնուհետև բեռնված առաքման խողովակը մտցվեց էնդոտրախեալ խողովակի մեջ՝ ծայրը դնելով մեր սպասվող կիրառական մագնիսական դաշտի ամենաուժեղ մասում:Պատկերի ընդունումը վերահսկվում էր մեր Arduino-ի վրա հիմնված ժամանակային տուփին միացված շնչառական դետեկտորի միջոցով, և բոլոր ազդանշանները (օրինակ՝ ջերմաստիճանը, շնչառությունը, կափարիչի բաց/փակումը և պատկերի ընդունումը) գրանցվեցին Powerlab-ի և LabChart-ի միջոցով (AD Instruments, Սիդնեյ, Ավստրալիա) 22 Պատկերում Երբ բնակարանն անհասանելի էր, երկու IP տեսախցիկներ (Panasonic BB-SC382) տեղադրվեցին մոտավորապես 90°-ով միմյանց նկատմամբ և օգտագործվեցին պատկերման ընթացքում մագնիսի դիրքը շնչափողի նկատմամբ վերահսկելու համար (Նկար 2b, c):Շարժման արտեֆակտները նվազագույնի հասցնելու համար շնչառական հոսքի տերմինալային սարահարթի ընթացքում ստացվել է մեկ պատկեր մեկ շնչով:
Մագնիսը կցվում է երկրորդ փուլին, որը կարող է տեղակայվել պատկերող մարմնի արտաքին մասում հեռակա կարգով:Փորձարկվել են մագնիսի տարբեր դիրքեր և կոնֆիգուրացիաներ, այդ թվում՝ տեղադրվել է շնչափողից մոտ 30° անկյան տակ (կոնֆիգուրացիաները ներկայացված են 2ա և 3ա նկարներում);մի մագնիսը կենդանու վերևում, իսկ մյուսը ներքևում, բևեռներով, որոնք նախատեսված են ձգողականության համար (Նկար 3b):, մեկ մագնիս կենդանու վերևում և մեկ ներքևում, բևեռներով սահմանված վանման համար (Նկար 3գ), և մեկ մագնիս վերևում և շնչափողին ուղղահայաց (Նկար 3դ):Կենդանին և մագնիսը կարգավորելուց և փորձարկվող MP-ին ներարկիչի պոմպի մեջ բեռնելուց հետո, պատկերներ ստանալուց հետո տրամադրեք 50 մկլ դոզան 4 մկլ/վ արագությամբ:Այնուհետև մագնիսը շարժվում է ետ ու առաջ շնչափողի երկայնքով կամ միջով, մինչդեռ շարունակում է պատկերներ ստանալ:
Մագնիսների կոնֆիգուրացիա in vivo պատկերման համար (ա) շնչափողից վերևում մեկ մագնիս՝ մոտավորապես 30° անկյան տակ, (բ) երկու մագնիսներ, որոնք կազմաձևված են ձգողականության համար, (գ) երկու մագնիսներ, որոնք կազմաձևված են վանման համար, (դ) մեկ մագնիս վերևում և ուղղահայաց։ շնչափող.Դիտորդը շնչափողով նայեց բերանից դեպի թոքերը, իսկ ռենտգենյան ճառագայթը անցավ առնետի ձախ կողմով և դուրս եկավ աջ կողմից:Մագնիսը կա՛մ շարժվում է շնչուղիների երկարությամբ, կա՛մ շնչափողից աջ ու ձախ՝ ռենտգենյան ճառագայթի ուղղությամբ:
Մենք նաև ձգտեցինք որոշել շնչառության և սրտի հաճախության խառնման բացակայության դեպքում մասնիկների տեսանելիությունն ու վարքը շնչուղիներում:Հետևաբար, պատկերազարդման շրջանի վերջում կենդանիները ենթարկվել են մարդկայնորեն էվթանազիայի՝ պենտոբարբիտալի գերդոզավորման պատճառով (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, ԱՄՆ; ~65 մգ/կգ IP):Որոշ կենդանիներ մնացել են պատկերազարդման հարթակում, իսկ շնչառության և սրտի բաբախյունի դադարեցումից հետո նկարազարդման գործընթացը կրկնվել է՝ ավելացնելով MP-ի լրացուցիչ չափաբաժին, եթե շնչուղիների մակերեսին MP տեսանելի չէ:
Ստացված պատկերները ուղղվեցին հարթ և մութ դաշտի համար, այնուհետև հավաքվեցին ֆիլմի մեջ (20 կադր վայրկյանում; 15–25 × նորմալ արագություն՝ կախված շնչառության արագությունից)՝ օգտագործելով MATLAB-ում գրված հատուկ սցենար (R2020a, The Mathworks):
LV գենի վեկտորի առաքման վերաբերյալ բոլոր ուսումնասիրություններն իրականացվել են Ադելաիդայի համալսարանի Կենդանիների լաբորատոր հետազոտական ​​կենտրոնում և նպատակ են ունեցել օգտագործել SPring-8 փորձի արդյունքները՝ գնահատելու, թե արդյոք LV-MP առաքումը մագնիսական դաշտի առկայության դեպքում կարող է ուժեղացնել գեների փոխանցումը in vivo: .MF-ի և մագնիսական դաշտի ազդեցությունները գնահատելու համար կենդանիների երկու խումբ բուժվել է. մի խմբին ներարկվել է LV MF մագնիսի տեղադրմամբ, իսկ մյուս խմբին ներարկվել է հսկիչ խումբ LV MF առանց մագնիսով:
LV գենի վեկտորները ստեղծվել են՝ օգտագործելով նախկինում նկարագրված մեթոդները 25, 26:LacZ վեկտորն արտահայտում է միջուկային տեղայնացված բետա-գալակտոզիդազի գենը, որը առաջնորդվում է MPSV-ի ստեղծող խթանիչով (LV-LacZ), որն արտադրում է կապույտ ռեակցիայի արտադրանք փոխակերպված բջիջներում, տեսանելի թոքերի հյուսվածքի ճակատներում և հատվածներում:Տիտրումն իրականացվել է բջջային կուլտուրաներում՝ ձեռքով հաշվելով LacZ-դրական բջիջների քանակը՝ օգտագործելով հեմոցիտոմետր՝ տիտրը TU/ml-ով հաշվարկելու համար:Կրիչները կրիոպահպանվում են -80°C-ում, հալեցնում են օգտագործելուց առաջ և կապում CombiMag-ին՝ խառնելով 1:1 հարաբերակցությամբ և ինկուբացնելով սառույցի վրա առաքումից առնվազն 30 րոպե առաջ:
Սովորական Sprague Dawley առնետներ (n = 3/խմբ, ~2-3 անզգայացված ip 0,4 մգ/կգ մեդետոմիդինի (Դոմիտոր, Իլիում, Ավստրալիա) և 60 մգ/կգ կետամինի (Իլիում, Ավստրալիա) խառնուրդով 1 ամսական տարիքում) ip ) ներարկային և ոչ վիրահատական ​​բանավոր կանալիզացիա 16 Ga ներերակային կանուլայով։Ապահովելու համար, որ շնչուղիների շնչուղիների հյուսվածքը ստանում է LV փոխակերպում, այն պայմանավորված է մեր նախկինում նկարագրված մեխանիկական խանգարման արձանագրությամբ, որում շնչափող շնչուղիների մակերեսը առանցքային քսվում է մետաղական զամբյուղով (N-Circle, նիտինոլ քարահանող առանց ծայրի NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, ԱՄՆ) 30 p28.Այնուհետև կենսաանվտանգության կաբինետում խառնաշփոթից մոտ 10 րոպե անց կատարվել է LV-MP-ի շնչափող կառավարում:
Այս փորձի մեջ օգտագործված մագնիսական դաշտը կազմաձևված էր նույն կերպ, ինչպես in vivo ռենտգեն հետազոտությունը, նույն մագնիսներով, որոնք պահվում էին շնչափողի վրա թորման ստենտի սեղմիչներով (Նկար 4):LV-MP-ի 50 մկլ ծավալը (2 x 25 մկլ չափաբաժիններ) փոխանցվել է շնչափողին (n = 3 կենդանի)՝ օգտագործելով գելային ծայրով պիպետտի, ինչպես նկարագրված է նախկինում:Վերահսկիչ խումբը (n = 3 կենդանիներ) ստացել է նույն LV-MP առանց մագնիսի օգտագործման:Ինֆուզիոն ավարտելուց հետո կաննուլան հեռացվում է էնդոտրախեալ խողովակից և կենդանուն արտահոսում են:Մագնիսը մնում է տեղում 10 րոպե՝ հեռացնելուց առաջ:Առնետներին ենթամաշկային չափաբաժին է տրվել մելոքսիկամով (1 մլ/կգ) (Իլիում, Ավստրալիա), որին հաջորդել է անզգայացման դադարեցումը 1 մգ/կգ ատիպամազոլի հիդրոքլորիդի ներերակային ներարկումով (Antisedan, Zoetis, Ավստրալիա):Առնետներին տաք են պահել և հսկել մինչև անզգայացումից հետո ամբողջական ապաքինումը:
LV-MP առաքման սարք կենսաբանական անվտանգության պահարանում:Դուք կարող եք տեսնել, որ ET խողովակի բաց մոխրագույն Luer-lock թեւը դուրս է ցցվում բերանից, իսկ նկարում ցուցադրված գել պիպետտի ծայրը մտցվում է ET խողովակի միջով մինչև ցանկալի խորությունը շնչափողի մեջ:
LV-MP վարչարարության ընթացակարգից մեկ շաբաթ անց կենդանիները մարդկայնորեն զոհաբերվեցին 100% CO2 ինհալացիայով, և LacZ-ի արտահայտումը գնահատվեց՝ օգտագործելով մեր ստանդարտ X-gal բուժումը:Հանվել են պոչային աճառի երեք օղակները, որպեսզի համոզվեն, որ էնդոտրախեալ խողովակի տեղադրման պատճառով ցանկացած մեխանիկական վնաս կամ հեղուկի պահպանում չի ներառվի վերլուծության մեջ:Յուրաքանչյուր շնչափող կտրվել է երկայնքով՝ վերլուծության համար երկու կես ստանալու համար և դրվել է սիլիկոնե ռետին պարունակող բաժակի մեջ (Sylgard, Dow Inc)՝ օգտագործելով Minutien ասեղ (Fine Science Tools)՝ լուսային մակերեսը պատկերացնելու համար:Փոխակերպված բջիջների բաշխումը և բնույթը հաստատվել են դիմային լուսանկարչության միջոցով՝ օգտագործելով Nikon մանրադիտակ (SMZ1500)՝ DigiLite տեսախցիկով և TCapture ծրագրաշարով (Tucsen Photonics, Չինաստան):Պատկերները ստացվել են 20x խոշորացմամբ (ներառյալ շնչափողի ամբողջ լայնության առավելագույն կարգավորումը), շնչափողի ողջ երկարությունը ցուցադրվում է քայլ առ քայլ՝ ապահովելով յուրաքանչյուր պատկերի միջև բավականաչափ համընկնումը, որպեսզի պատկերները «կարեն»:Յուրաքանչյուր շնչափողից ստացված պատկերները այնուհետև միավորվեցին մեկ կոմպոզիտային պատկերի մեջ՝ օգտագործելով Composite Image Editor տարբերակը 2.0.3 (Microsoft Research)՝ օգտագործելով հարթ շարժման ալգորիթմը: Յուրաքանչյուր կենդանու շնչափողային կոմպոզիտային պատկերներում LacZ արտահայտության տարածքը քանակականացվել է ավտոմատացված MATLAB սկրիպտի միջոցով (R2020a, MathWorks), ինչպես նախկինում նկարագրված էր28, օգտագործելով 0,35 <Երանգ <0,58, հագեցվածություն> 0,15 և արժեք <0,7: Յուրաքանչյուր կենդանու շնչափողային կոմպոզիտային պատկերների ներսում LacZ արտահայտության տարածքը քանակականացվել է ավտոմատացված MATLAB սկրիպտի միջոցով (R2020a, MathWorks), ինչպես նախկինում նկարագրված է28, օգտագործելով 0,35 <Երանգ <0,58, հագեցվածություն> 0,15 և արժեք <0,7: Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была количественноа определено со использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), ինչպես է оценка на <5,28, насыщенность> 0,15 и значение <0 , 7. Յուրաքանչյուր կենդանու կոմպոզիտային շնչափող պատկերներում LacZ արտահայտության տարածքը քանակականացվել է ավտոմատացված MATLAB սկրիպտի միջոցով (R2020a, MathWorks), ինչպես նախկինում նկարագրված էր28՝ օգտագործելով 0,35 պարամետրերը:0,15 եւ արժեքը<0 ,7.如前所述，使用自动MATLAB 脚本（R2020a，MathWorks）对来自每只动物的气管复本（R2020a，对来自每只动物的气管复合合自自进行量化，使用0.35 < 色调< 0.58、饱和度> 0.15 和值< 0.7 的设置。如 前所 述 ， 自动 自动 Matlab 脚本 （（r2020a ， Mathworks） 来自 每 只 的 气管 复表达 量化 ， 使用 使用 使用 0.35 <色调 <0.58 、> 0.15 和值 <0.7 的。。。。 ՀԻՊ ..... Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определяли со использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, сользования <5,000 0,15 և նշանակություն <0,7 . Յուրաքանչյուր կենդանու շնչափողի կոմպոզիտային պատկերների վրա LacZ արտահայտության տարածքները քանակականացվել են՝ օգտագործելով ավտոմատացված MATLAB սկրիպտը (R2020a, MathWorks), ինչպես նախկինում նկարագրված էր՝ օգտագործելով 0.35 < երանգ <0.58, հագեցվածություն > 0.15 և արժեքը <0.7:GIMP v2.10.24-ում հյուսվածքների ուրվագծերը հետևելով՝ յուրաքանչյուր կոմպոզիտային պատկերի համար ձեռքով ստեղծվեց դիմակ՝ հյուսվածքի տարածքը բացահայտելու և շնչափողի հյուսվածքից դուրս ցանկացած կեղծ հայտնաբերումը կանխելու համար:Յուրաքանչյուր կենդանու բոլոր կոմպոզիտային պատկերներից ներկված տարածքները ամփոփվել են, որպեսզի տրվի այդ կենդանու համար ներկված ընդհանուր տարածքը:Այնուհետև ներկված տարածքը բաժանվեց դիմակի ընդհանուր մակերեսի վրա՝ նորմալացված տարածք ստանալու համար:
Յուրաքանչյուր շնչափող մտցվել է պարաֆինի մեջ և կտրվել 5 մկմ հաստությամբ:Հատվածները 5 րոպեի ընթացքում հականերկվել են չեզոք արագ կարմիրով, և պատկերները ձեռք են բերվել Nikon Eclipse E400 մանրադիտակի, DS-Fi3 տեսախցիկի և NIS տարրերի գրավման ծրագրաշարի միջոցով (տարբերակ 5.20.00):
Բոլոր վիճակագրական վերլուծությունները կատարվել են GraphPad Prism v9-ում (GraphPad Software, Inc.):Վիճակագրական նշանակությունը սահմանվել է p ≤ 0,05:Նորմալությունը փորձարկվել է Shapiro-Wilk թեստի միջոցով, և LacZ-ի ներկման տարբերությունները գնահատվել են չզույգված t-թեստի միջոցով:
Աղյուսակ 1-ում նկարագրված վեց պատգամավորները հետազոտվել են PCXI-ով, իսկ տեսանելիությունը նկարագրված է Աղյուսակ 2-ում: Երկու պոլիստիրոլի պատգամավորներ (MP1 և MP2; 18 մկմ և 0,25 մկմ, համապատասխանաբար) տեսանելի չէին PCXI-ով, սակայն մնացած նմուշները կարող էին նույնականացվել: (օրինակները ներկայացված են Նկար 5-ում):MP3-ը և MP4-ը թույլ տեսանելի են (10-15% Fe3O4; 0,25 մկմ և 0,9 մկմ, համապատասխանաբար):Չնայած MP5-ը (98% Fe3O4; 0,25 մկմ) պարունակում էր փորձարկված ամենափոքր մասնիկներից մի քանիսը, այն ամենաընդգծվածն էր:CombiMag MP6 արտադրանքը դժվար է տարբերել:Բոլոր դեպքերում, MF-ներ հայտնաբերելու մեր կարողությունը զգալիորեն բարելավվել է՝ մազանոթին զուգահեռ ետ ու առաջ շարժելով մագնիսը:Երբ մագնիսները հեռանում էին մազանոթից, մասնիկները դուրս էին քաշվում երկար շղթաներով, բայց երբ մագնիսները մոտենում էին, և մագնիսական դաշտի ուժգնությունը մեծանում էր, մասնիկների շղթաները կրճատվում էին, քանի որ մասնիկները գաղթում էին դեպի մազանոթի վերին մակերեսը (տես Լրացուցիչ տեսանյութ S1 MP4), ավելացնելով մասնիկների խտությունը մակերեսի վրա:Եվ հակառակը, երբ մագնիսը հանվում է մազանոթից, դաշտի ուժգնությունը նվազում է, և պատգամավորները վերադասավորվում են երկար շղթաների մեջ, որոնք տարածվում են մազանոթի վերին մակերևույթից (տե՛ս Լրացուցիչ տեսանյութ S2. MP4):Այն բանից հետո, երբ մագնիսը դադարում է շարժվել, մասնիկները շարունակում են շարժվել հավասարակշռության դիրքի հասնելուց հետո որոշ ժամանակ:Երբ պատգամավորը շարժվում է դեպի և հեռանում է մազանոթի վերին մակերեսից, մագնիսական մասնիկները հակված են բեկորներ քաշել հեղուկի միջով:
MPXI-ի տեսանելիությունը նմուշների միջև զգալիորեն տարբերվում է:(ա) MP3, (բ) MP4, (գ) MP5 և (դ) MP6:Այստեղ ցուցադրված բոլոր պատկերներն արվել են մագնիսի միջոցով, որը տեղադրված է մոտավորապես 10 մմ ուղիղ մազանոթի վերևում:Ակնհայտ մեծ շրջանակները օդային փուչիկներ են, որոնք թակարդված են մազանոթներում, որոնք հստակ ցույց են տալիս ֆազային կոնտրաստի պատկերի սև և սպիտակ եզրային առանձնահատկությունները:Կարմիր վանդակը ցույց է տալիս խոշորացումը, որը մեծացնում է հակադրությունը:Նկատի ունեցեք, որ մագնիսների սխեմաների տրամագծերը բոլոր պատկերներում չափի չեն և մոտավորապես 100 անգամ ավելի մեծ են, քան ցույց է տրված:
Երբ մագնիսը շարժվում է աջ և ձախ մազանոթի վերևի երկայնքով, MP պարանի անկյունը փոխվում է մագնիսի հետ համահունչ (տես Նկար 6), այդպիսով ուրվագծելով մագնիսական դաշտի գծերը:MP3-5-ի համար, երբ ակորդը հասնում է շեմային անկյունին, մասնիկները քաշվում են մազանոթի վերին մակերևույթի երկայնքով:Սա հաճախ հանգեցնում է նրան, որ պատգամավորները հավաքվում են ավելի մեծ խմբերի մոտ, որտեղ մագնիսական դաշտն ամենաուժեղն է (տես Լրացուցիչ տեսանյութ S3. MP5):Սա հատկապես ակնհայտ է նաև մազանոթի ծայրին մոտ պատկերելիս, ինչը հանգեցնում է նրան, որ պատգամավորը կուտակվում և կենտրոնանում է հեղուկ-օդ միջերեսում:MP6-ի մասնիկները, որոնք ավելի դժվար էր տարբերվում, քան MP3-5-ի մասնիկները, չէին քաշվում, երբ մագնիսը շարժվում էր մազանոթի երկայնքով, բայց MP լարերը տարանջատվեցին՝ թողնելով մասնիկները տեսադաշտում (տես լրացուցիչ տեսանյութ S4: MP6):Որոշ դեպքերում, երբ կիրառվող մագնիսական դաշտը կրճատվում էր՝ մագնիսը պատկերի տեղամասից մեծ հեռավորության վրա տեղափոխելով, մնացած պատգամավորները ձգողականության ուժով դանդաղ իջնում ​​էին դեպի խողովակի ներքևի մակերևույթը՝ մնալով լարերի մեջ (տես Լրացուցիչ տեսանյութ S5: MP3) .
MP պարանի անկյունը փոխվում է, երբ մագնիսը շարժվում է դեպի աջ մազանոթից վեր:(ա) MP3, (բ) MP4, (գ) MP5 և (դ) MP6:Կարմիր վանդակը ցույց է տալիս խոշորացումը, որը մեծացնում է հակադրությունը:Խնդրում ենք նկատի ունենալ, որ լրացուցիչ տեսանյութերը տեղեկատվական նպատակներով են, քանի որ դրանք բացահայտում են կարևոր մասնիկների կառուցվածքը և դինամիկ տեղեկատվություն, որը հնարավոր չէ պատկերացնել այս ստատիկ պատկերներում:
Մեր փորձարկումները ցույց են տվել, որ շնչափողի երկայնքով մագնիսը դանդաղ ետ ու առաջ շարժելը հեշտացնում է MF-ի պատկերացումը in vivo բարդ շարժման համատեքստում:Ոչ մի in vivo փորձարկում չի իրականացվել, քանի որ պոլիստիրոլի ուլունքները (MP1 և MP2) տեսանելի չէին մազանոթում:Մնացած չորս MF-ներից յուրաքանչյուրը փորձարկվել է in vivo մագնիսի երկար առանցքով, որը տեղադրված է շնչափողի վրա մոտ 30° դեպի ուղղահայաց անկյան տակ (տես Նկարներ 2b և 3a), քանի որ դա հանգեցրել է ավելի երկար MF շղթաների և ավելի արդյունավետ: քան մագնիս:.կոնֆիգուրացիան ավարտված է:MP3, MP4 և MP6 ոչ մի կենդանի կենդանու շնչափողում չեն հայտնաբերվել:Կենդանիներին մարդկայնորեն սպանելուց հետո առնետների շնչառական ուղիները պատկերացնելիս մասնիկները մնացին անտեսանելի նույնիսկ այն դեպքում, երբ լրացուցիչ ծավալ ավելացվեց ներարկիչի պոմպի միջոցով:MP5-ն ուներ ամենաբարձր երկաթի օքսիդի պարունակությունը և միակ տեսանելի մասնիկն էր, ուստի այն օգտագործվում էր MP-ի վարքը in vivo-ում գնահատելու և բնութագրելու համար:
MF-ի տեղադրման ժամանակ մագնիսի տեղադրումը շնչափողի վրա հանգեցրեց նրան, որ շատ, բայց ոչ բոլորը, MF-ները կենտրոնացան տեսադաշտում:Մասնիկների շնչափող մուտքը լավագույնս նկատվում է մարդկայնորեն էվթանազիայի ենթարկված կենդանիների մոտ:Նկար 7 և լրացուցիչ տեսանյութ S6. MP5-ը ցույց է տալիս արագ մագնիսական գրավումը և մասնիկների հավասարեցումը փորային շնչափողի մակերեսին, ինչը ցույց է տալիս, որ պատգամավորները կարող են թիրախավորվել շնչափողի ցանկալի հատվածներին:MF-ի առաքումից հետո շնչափողի երկայնքով ավելի հեռավոր որոնելիս որոշ MF-ներ հայտնաբերվել են կարինային ավելի մոտ, ինչը ցույց է տալիս մագնիսական դաշտի անբավարար ուժ՝ բոլոր ՄՖ-ները հավաքելու և պահելու համար, քանի որ դրանք փոխանցվել են առավելագույն մագնիսական դաշտի ուժգնությամբ հեղուկի ընդունման ժամանակ:գործընթաց։Այնուամենայնիվ, հետծննդյան MP կոնցենտրացիան ավելի բարձր է եղել պատկերի տարածքում, ինչը ենթադրում է, որ շատ պատգամավորներ մնացել են շնչուղիների շրջաններում, որտեղ կիրառվող մագնիսական դաշտի ուժգնությունն ամենաբարձրն է եղել:
Պատկերներ (ա) նախքան և (բ) MP5-ը վերջերս էվթանազավորված առնետի շնչափող առաքվելուց հետո՝ մագնիսով, որը տեղադրված է պատկերազերծման տարածքի վերևում:Պատկերված տարածքը գտնվում է աճառային երկու օղակների միջև։Մինչ պատգամավորի ծննդաբերությունը շնչուղիներում որոշակի հեղուկ կա:Կարմիր վանդակը ցույց է տալիս խոշորացումը, որը մեծացնում է հակադրությունը:Այս պատկերները վերցված են S6-ում ներկայացված տեսանյութից՝ MP5 լրացուցիչ տեսանյութ:
Մագնիսը շնչափողի երկայնքով in vivo տեղափոխելը հանգեցրեց շնչուղիների մակերեսի վրա MP շղթայի անկյան փոփոխությանը, որը նման է մազանոթներում նկատվածին (տես Նկար 8 և լրացուցիչ տեսանյութ S7. MP5):Այնուամենայնիվ, մեր ուսումնասիրության մեջ պատգամավորներին հնարավոր չէր քարշ տալ կենդանի շնչառական ուղիների մակերեսով, ինչպես կարող էին անել մազանոթները:Որոշ դեպքերում MP շղթան երկարանում է, երբ մագնիսը շարժվում է աջ և ձախ:Հետաքրքիր է, որ մենք նաև պարզեցինք, որ մասնիկների շղթան փոխում է հեղուկի մակերևութային շերտի խորությունը, երբ մագնիսը երկայնքով շարժվում է շնչափողի երկայնքով, և ընդլայնվում է, երբ մագնիսը տեղափոխվում է ուղղակիորեն վերևում, և մասնիկների շղթան պտտվում է ուղղահայաց դիրքի (տես. Լրացուցիչ տեսանյութ S7):MP5 ժամը 0:09, ներքևի աջ):Հատկանշական շարժման օրինաչափությունը փոխվեց, երբ մագնիսը կողային տեղափոխվեց շնչափողի վերևում (այսինքն, կենդանու ձախ կամ աջ կողմը, այլ ոչ թե շնչափողի երկարությամբ):Իրենց շարժման ընթացքում մասնիկները դեռ հստակ տեսանելի էին, բայց երբ մագնիսը հեռացվեց շնչափողից, մասնիկների լարերի ծայրերը տեսանելի դարձան (տե՛ս Լրացուցիչ տեսանյութ S8. MP5, սկսած 0:08-ից):Սա համընկնում է մագնիսական դաշտի դիտարկված վարքագծին՝ ապակե մազանոթում կիրառվող մագնիսական դաշտի ազդեցության տակ։
Նմուշի պատկերներ, որոնք ցույց են տալիս MP5-ը կենդանի անզգայացված առնետի շնչափողում:ա) Մագնիսն օգտագործվում է շնչափողի վերևում և ձախ կողմում պատկերներ ստանալու համար, այնուհետև (բ) մագնիսը աջ տեղափոխելուց հետո:Կարմիր վանդակը ցույց է տալիս խոշորացումը, որը մեծացնում է հակադրությունը:Այս պատկերները S7-ի լրացուցիչ տեսանյութում ներկայացված տեսանյութից են՝ MP5:
Երբ երկու բևեռները տրախեայի վերևում և ներքևում լարվում էին հյուսիս-հարավ կողմնորոշմամբ (այսինքն՝ ձգող; Նկար 3b), MP ակորդները ավելի երկար էին երևում և տեղակայված էին շնչափողի կողային պատին, այլ ոչ թե թիկունքային մակերեսին: շնչափող (տես Հավելված):Տեսանյութ S9:MP5).Այնուամենայնիվ, մասնիկների բարձր կոնցենտրացիաները մեկ տեղամասում (այսինքն՝ շնչափողի թիկունքային մակերեսը) չեն հայտնաբերվել հեղուկի ընդունումից հետո՝ օգտագործելով երկմագնիս սարք, որը սովորաբար տեղի է ունենում մեկ մագնիս սարքի դեպքում:Այնուհետև, երբ մեկ մագնիսը կազմաձևվեց հակառակ բևեռները վանելու համար (Նկար 3c), տեսադաշտում տեսանելի մասնիկների թիվը առաքումից հետո չավելացավ:Երկու մագնիսների կոնֆիգուրացիաների ստեղծումը դժվար է մագնիսական դաշտի բարձր ուժի պատճառով, որը համապատասխանաբար ձգում կամ մղում է մագնիսները:Այնուհետև կարգավորումը փոխվեց շնչուղիներին զուգահեռ մեկ մագնիսով, որը անցնում էր օդուղիներով 90 աստիճանի անկյան տակ, այնպես որ ուժի գծերը ուղղահայաց հատում էին շնչափողի պատը (Նկար 3d), մի կողմնորոշում, որը նախատեսված է որոշելու մասնիկների կուտակման հնարավորությունը: կողային պատը.դիտարկել.Այնուամենայնիվ, այս կոնֆիգուրացիայի մեջ չկար նույնականացնող MF կուտակման շարժում կամ մագնիսի շարժում:Այս բոլոր արդյունքների հիման վրա ընտրվել է մեկ մագնիսով և 30 աստիճանի կողմնորոշում ունեցող կոնֆիգուրացիա՝ գեների կրիչների in vivo ուսումնասիրությունների համար (նկ. 3ա):
Երբ կենդանին մարդկայնորեն զոհաբերվելուց անմիջապես հետո մի քանի անգամ պատկերվել է, հյուսվածքների խանգարող շարժման բացակայությունը նշանակում էր, որ ավելի նուրբ, կարճ մասնիկների գծերը կարող էին նկատվել մաքուր միջաճառային դաշտում՝ «ճոճվելով» մագնիսի թարգմանական շարժմանը համապատասխան:հստակ տեսեք MP6 մասնիկների առկայությունը և շարժումը:
LV-LacZ-ի տիտրը եղել է 1,8 x 108 IU/mL, և CombiMag MP-ի (MP6) հետ 1:1 խառնելուց հետո կենդանիներին ներարկվել է 50 մկլ շնչափող 9 x 107 IU/ml LV փոխադրամիջոց (այսինքն՝ 4,5): x 106 TU/rat):)).Այս ուսումնասիրություններում, ծննդաբերության ընթացքում մագնիսը տեղափոխելու փոխարեն, մենք մագնիսը ամրացրեցինք մեկ դիրքում՝ որոշելու, թե արդյոք LV փոխակերպումը կարող է (ա) բարելավվել՝ համեմատած վեկտորի առաքման հետ՝ մագնիսական դաշտի բացակայության դեպքում, և (բ) եթե օդուղին կարող է. կենտրոնացած լինել.Բջիջները, որոնք փոխակերպվում են վերին շնչուղիների մագնիսական թիրախային տարածքներում:
Մագնիսների առկայությունը և CombiMag-ի օգտագործումը LV վեկտորների հետ համատեղ, ըստ երևույթին, բացասաբար չեն ազդել կենդանիների առողջության վրա, ինչպես դա արեց մեր ստանդարտ LV վեկտորի առաքման արձանագրությունը:Մեխանիկական շեղումների ենթարկված շնչափողի շրջանի ճակատային պատկերները (Լրացուցիչ Նկ. 1) ցույց են տվել, որ LV-MP բուժված խումբը մագնիսի առկայության դեպքում փոխակերպման զգալիորեն ավելի բարձր մակարդակ է ունեցել (նկ. 9ա):Վերահսկիչ խմբում առկա էր միայն կապույտ LacZ ներկման փոքր քանակություն (Նկար 9b):X-Gal-ով ներկված նորմալացված շրջանների քանակականացումը ցույց է տվել, որ LV-MP-ի կիրառումը մագնիսական դաշտի առկայության դեպքում հանգեցրել է մոտ 6 անգամ բարելավման (նկ. 9c):
Կոմպոզիտային պատկերների օրինակ, որը ցույց է տալիս շնչափողի փոխակերպումը LV-MP-ով (ա) մագնիսական դաշտի առկայության դեպքում և (բ) մագնիսի բացակայության դեպքում:գ) Վիճակագրորեն զգալի բարելավում շնչափողում LacZ փոխակերպման նորմալացված հատվածում մագնիսի օգտագործմամբ (*p = 0,029, t-թեստ, n = 3 յուրաքանչյուր խմբի համար, միջին ± ստանդարտ սխալ):
Չեզոք արագ կարմիր ներկված հատվածները (օրինակը ցույց է տրված Լրացուցիչ Նկար 2-ում) ցույց են տվել, որ LacZ-ով ներկված բջիջները առկա են նույն նմուշում և նույն տեղում, ինչպես նախկինում հաղորդվել է:
Շնչուղիների գենային թերապիայի հիմնական մարտահրավերը մնում է կրիչի մասնիկների ճշգրիտ տեղայնացումը հետաքրքրության վայրերում և շարժական թոքերի մեջ փոխազդեցության արդյունավետության բարձր մակարդակի ձեռքբերումը օդի հոսքի և լորձի ակտիվ մաքրման առկայության դեպքում:Կիստիկական ֆիբրոզում շնչառական հիվանդությունների բուժման համար նախատեսված LV կրիչների համար մինչ այժմ անհասանելի նպատակ է եղել հաղորդիչ շնչուղիներում կրող մասնիկների բնակության ժամանակի ավելացումը:Ինչպես նշում է Castellani-ն և այլոք, մագնիսական դաշտերի օգտագործումը փոխակերպումը ուժեղացնելու համար առավելություններ ունի գեների փոխանցման այլ մեթոդների նկատմամբ, ինչպիսիք են էլեկտրոպորացիան, քանի որ այն կարող է համատեղել պարզությունը, տնտեսությունը, տեղայնացված առաքումը, արդյունավետության բարձրացումը և ինկուբացիոն ավելի կարճ ժամանակը:և, հնարավոր է, փոխադրամիջոցի ավելի ցածր չափաբաժին10:Այնուամենայնիվ, օդուղիներում մագնիսական մասնիկների in vivo նստեցումը և վարքագիծը արտաքին մագնիսական ուժերի ազդեցության տակ երբեք չի նկարագրվել, և իրականում այս մեթոդի կարողությունը բարձրացնելու գեների արտահայտման մակարդակը անձեռնմխելի կենդանի շնչուղիներում չի ցուցադրվել in vivo-ում:
PCXI սինքրոտրոնի վրա մեր in vitro փորձերը ցույց տվեցին, որ մեր փորձարկված բոլոր մասնիկները, բացառությամբ MP պոլիստիրոլի, տեսանելի են մեր օգտագործած պատկերային կարգավորումներում:Մագնիսական դաշտի առկայության դեպքում մագնիսական դաշտերը կազմում են թելեր, որոնց երկարությունը կապված է մասնիկների տեսակի և մագնիսական դաշտի ուժգնության հետ (այսինքն՝ մագնիսի մոտիկության և շարժման հետ):Ինչպես ցույց է տրված Նկար 10-ում, տողերը, որոնք մենք դիտում ենք, ձևավորվում են, երբ յուրաքանչյուր առանձին մասնիկ մագնիսանում է և առաջացնում է իր տեղական մագնիսական դաշտը:Այս առանձին դաշտերը ստիպում են այլ նմանատիպ մասնիկներ հավաքել և միանալ խմբային լարային շարժումների հետ՝ կապված այլ մասնիկների ձգող և վանող տեղական ուժերի տեղական ուժերի հետ։
Դիագրամ, որը ցույց է տալիս (ա, բ) մասնիկների շղթաներ, որոնք ձևավորվում են հեղուկով լցված մազանոթների ներսում և (գ, դ) օդով լցված շնչափող:Նկատի ունեցեք, որ մազանոթները և շնչափողը մասշտաբով չեն ձգվում:Վահանակը (ա) պարունակում է նաև շղթաներով դասավորված Fe3O4 մասնիկներ պարունակող MF-ի նկարագրությունը:
Երբ մագնիսը շարժվեց մազանոթի վրայով, մասնիկների շարանի անկյունը հասավ Fe3O4 պարունակող MP3-5-ի կրիտիկական շեմին, որից հետո մասնիկի շարանը այլևս չմնաց իր սկզբնական դիրքում, այլ մակերեսի երկայնքով տեղափոխվեց նոր դիրք:մագնիս.Այս էֆեկտը, հավանաբար, տեղի է ունենում, քանի որ ապակե մազանոթի մակերեսը բավականաչափ հարթ է, որպեսզի թույլ տա այս շարժումը տեղի ունենալ:Հետաքրքիր է, որ MP6-ը (CombiMag) իրեն այդպես չէր պահում, հավանաբար այն պատճառով, որ մասնիկներն ավելի փոքր էին, ունեին այլ ծածկույթ կամ մակերեսային լիցք, կամ հատուկ կրող հեղուկը ազդեց նրանց շարժվելու ունակության վրա:CombiMag մասնիկների պատկերի հակադրությունը նույնպես ավելի թույլ է, ինչը ենթադրում է, որ հեղուկը և մասնիկները կարող են ունենալ նույն խտությունը և, հետևաբար, չեն կարող հեշտությամբ շարժվել դեպի միմյանց:Մասնիկները կարող են նաև խրվել, եթե մագնիսը շատ արագ է շարժվում, ինչը ցույց է տալիս, որ մագնիսական դաշտի ուժը չի կարող միշտ հաղթահարել հեղուկի մասնիկների միջև շփումը, ինչը ենթադրում է, որ մագնիսական դաշտի ուժգնությունը և մագնիսի և թիրախի տարածքի միջև հեռավորությունը չպետք է լինի անակնկալ.կարևոր.Այս արդյունքները նաև ցույց են տալիս, որ թեև մագնիսները կարող են գրավել բազմաթիվ միկրոմասնիկներ, որոնք հոսում են թիրախային տարածքով, դժվար թե մագնիսների վրա հենվենք CombiMag մասնիկները շնչափողի մակերևույթով տեղափոխելու համար:Այսպիսով, մենք եզրակացրինք, որ in vivo LV MF-ի ուսումնասիրությունները պետք է օգտագործեն ստատիկ մագնիսական դաշտեր՝ շնչուղիների ծառի որոշակի հատվածները ֆիզիկապես թիրախավորելու համար:
Երբ մասնիկները ներթափանցվում են մարմին, դրանք դժվար է նույնականացնել մարմնի բարդ շարժվող հյուսվածքի համատեքստում, սակայն դրանց հայտնաբերման հնարավորությունը բարելավվել է՝ մագնիսը հորիզոնական շարժելով շնչափողի վրայով, որպեսզի «թափահարի» MP լարերը:Թեև իրական ժամանակում պատկերազարդումը հնարավոր է, կենդանին մարդկայնորեն սպանվելուց հետո ավելի հեշտ է նկատել մասնիկների շարժումը:MP-ի կոնցենտրացիաները սովորաբար ամենաբարձրն էին այս վայրում, երբ մագնիսը տեղադրվում էր պատկերազերծման տարածքում, թեև որոշ մասնիկներ սովորաբար հայտնաբերվում էին շնչափողից ավելի ներքև:Ի տարբերություն in vitro հետազոտությունների, մասնիկները չեն կարող քաշվել շնչափողով մագնիսի շարժումով:Այս բացահայտումը համահունչ է նրան, թե ինչպես է շնչափողի մակերեսը ծածկող լորձը սովորաբար մշակում ներշնչված մասնիկները՝ փակելով դրանք լորձի մեջ և հետագայում մաքրելով դրանք լորձաթաղանթային մաքրման մեխանիզմի միջոցով:
Մենք ենթադրեցինք, որ շնչափողի վերևում և ներքևում գտնվող մագնիսների օգտագործումը ներգրավման համար (նկ. 3b) կարող է հանգեցնել ավելի միատեսակ մագնիսական դաշտի, այլ ոչ թե մագնիսական դաշտի, որը շատ կենտրոնացած է մի կետում, ինչը կարող է հանգեցնել մասնիկների ավելի միասնական բաշխման:.Այնուամենայնիվ, մեր նախնական ուսումնասիրությունը չգտավ այս վարկածը հաստատող հստակ ապացույցներ:Նմանապես, զույգ մագնիսների հակահարվածի վրա դնելը (նկ. 3c) չի հանգեցրել ավելի շատ մասնիկների նստեցման պատկերի տարածքում:Այս երկու բացահայտումները ցույց են տալիս, որ կրկնակի մագնիսների կարգավորումը էապես չի բարելավում MP-ի մատնանշման տեղական կառավարումը, և որ արդյունքում առաջացող ուժեղ մագնիսական ուժերը դժվար է կարգավորել՝ դարձնելով այս մոտեցումը պակաս գործնական:Նմանապես, մագնիսի կողմնորոշումը շնչափողի վերևում և միջով (Նկար 3d) նույնպես չի մեծացրել պատկերված տարածքում մնացած մասնիկների թիվը:Այս այլընտրանքային կոնֆիգուրացիաներից մի քանիսը կարող են հաջող չլինել, քանի որ դրանք հանգեցնում են նստեցման գոտում մագնիսական դաշտի ուժի նվազմանը:Այսպիսով, մեկ մագնիսի կոնֆիգուրացիան 30 աստիճանով (նկ. 3ա) համարվում է ամենապարզ և ամենաարդյունավետ in vivo փորձարկման մեթոդը:
LV-MP ուսումնասիրությունը ցույց է տվել, որ երբ LV վեկտորները զուգակցվում էին CombiMag-ի հետ և առաքվում էին մագնիսական դաշտի առկայության դեպքում ֆիզիկապես անհանգստանալուց հետո, փոխակերպման մակարդակը զգալիորեն աճում էր շնչափողում՝ համեմատած հսկիչների հետ:Հիմնվելով սինքրոտրոնային պատկերման ուսումնասիրությունների և LacZ-ի արդյունքների վրա՝ մագնիսական դաշտը, ըստ երևույթին, ի վիճակի է պահել LV-ն շնչափողում և նվազեցնել վեկտորային մասնիկների քանակը, որոնք անմիջապես ներթափանցել են թոքեր:Թիրախավորման նման բարելավումները կարող են հանգեցնել ավելի բարձր արդյունավետության՝ միաժամանակ նվազեցնելով առաքվող տիտրերը, ոչ նպատակային փոխակերպումը, բորբոքային և իմունային կողմնակի ազդեցությունները և գեների փոխանցման ծախսերը:Կարևոր է, ըստ արտադրողի, CombiMag-ը կարող է օգտագործվել գեների փոխանցման այլ մեթոդների հետ համատեղ, ներառյալ այլ վիրուսային վեկտորները (օրինակ՝ AAV) և նուկլեինաթթուները: